NÁVOD

o použití reagenčnej súpravy na kolorimetrické stanovenie bielkovín v moči a mozgovomiechovom moku s pyrogallolom t

Súprava obsahuje:

200 ml (2 x 100 ml P + 2 x 2 ml kalibrátor)

500 ml (2 x 250 ml P + 2 x 5 ml kalibrátor)

Princíp metódy

Keď proteín interaguje s pyrogallolom červenej a

molybdénan sodný tvorí farebný komplex,

intenzita farby je úmerná koncentrácii

Obsah súpravy

Roztok činidla (P) - pyrogallolu v sukcináte

pufer pripravený na použitie.

Kalibrátory - nízko kalibračné proteínové roztoky (0,20

g / l, použité na stanovenie mikroproteinúrie) a vysoké

(0,50 g / l, použité na stanovenie proteinúrie)

koncentrácia proteínu obsahujúca 70% albumínu a 30%

globulín pripravený na použitie.

Skladovacia súprava - pri teplote 2-8 ° C v balení

po celú dobu použiteľnosti.

Stabilita činidla a kalibrátorov

Po otvorení je činidlo stabilné 6 mesiacov, kalibrátory - 3 mesiace. pri skladovaní v tesne uzavretej forme pri teplote 2-8 ° C na tmavom mieste.

Normálne hodnoty

• moč - do 0,120 g / l (do 0,141 g / deň);
• mozgovomiechového moku (CSF) - 0,150-0,450 g / l.

Vzorky na analýzu

Moč, nehemolyzovaný CSF.

Príprava na analýzu

1. CSF a moč sa centrifugovali 10 minút pri 2700 až 4000 ot / min.
2. Na analýzu používajte čisté, dobre premyté skúmavky. Testom vhodnosti testovacích skúmaviek na analýzu je neprítomnosť zmeny farby v činidle. Ak sa činidlo zmení na modré bez pridania vzorky, výsledky stanovenia proteínu sa nadhodnotia; preto najprv dávkujte činidlo a potom pridajte moč.
3. Pri nastavovaní metódy by sa mali použiť nové kyvety, pretože nie sú zafarbené činidlom a reakčnou vzorkou. Staré plastové kyvety (zakalené, netransparentné) nie sú vhodné na meranie. Pred použitím upravte kyvety, ktoré sa používali, nasledujúcim spôsobom: nechajte 10 minút v premývacom roztoku (200 ml 5% roztoku peroxidu vodíka alebo 1 ml detergentu), potom opláchnite kohútikom a destilovanou vodou najmenej 10 krát. Súprava je vhodná na analýzu biochemických poloautomatických a automatických analyzátorov.

Analýza: vlnová dĺžka: 598 (578 - 620) nm; dĺžka optickej dráhy: 10 mm; teplota: 18-25 ° C

Pred analýzou by sa reagencia a kalibrátor mali uchovávať pri izbovej teplote približne 30 minút.

Postup 1 (stanovenie proteinúrie)

Vzorky sa premiešajú, uchovávajú sa 10 minút pri izbovej teplote (18-25 ° C). Zmerajte optickú hustotu experimentálnych (E) a kalibračných (EC) vzoriek proti kontrolnej (slepej) vzorke. Farba je stabilná 1 hodinu.

ČO ROBIŤ V METÓDE URINE SULFOSALYCYL?

V našej krajine sa turbidimetrická metóda používajúca kyselinu sulfosalicylovú (sulfosalicylová metóda), ktorú prvýkrát navrhol Kingsbury F, používa hlavne na stanovenie koncentrácie proteínu v moči. B. a spoluautori v roku 1926. Laboratóriá vyspelých krajín zároveň túto metódu prakticky nepoužívajú, výsledkom čoho je laboratórna kontrola kvality proteínových analýz moču, ktorá ukazuje pokles variačného koeficientu. V roku 1993 teda 60% francúzskych klinických diagnostických laboratórií vykonalo stanovenie koncentrácie bielkovín v moči pomocou kolorimetrickej metódy s použitím pyrogallolového červeného farbiva (pyrogallolová metóda) a iba 10% použitím sulfosalicylovej metódy. Diagnostické súpravy na stanovenie proteínov v moči na základe pyrogallolovej metódy vyrábajú také známe spoločnosti ako Bayer D iagnostics, Beckman, Biodirect, Biocon Diagnostik, Bio-Rad Laboratories, Eurodiag, Kone, Merck, Randox, Serono, Sentinel CH, Sigma. Bohužiaľ, v našej krajine, z ekonomických dôvodov a čiastočne kvôli nedostatku skúseností, kolorimetrické metódy na stanovenie proteínov moču sú stále veľmi málo používané.

Vynára sa otázka - aké oprávnené je odmietnutie laboratórií vo vyspelých krajinách používať jednoduchú, a čo je najdôležitejšie, lacnú metódu. Na objasnenie tejto otázky sme porovnávali výsledky stanovenia koncentrácie proteínu v moči pacientov dvoma spôsobmi: sulfosalicylovou [1] a pyrogallolom [2].

Postup merania koncentrácie proteínu každou metódou bol nasledujúci.

Činidlá: 3% roztok kyseliny sulfosalicylovej, 0,9% roztok chloridu sodného,

Kalibrátor (kalibračný roztok sérového albumínu, 50 g / l, v roztoku chloridu sodného, ​​0,9% a azidu sodného, ​​0,095%) zo súpravy „Uni-Test - Total Protein“ vyrobenej v „Diakon DS“ podľa poradia „A / O Unimed ”.

Zariadenia: spektrofotometer SF-2000 vyrábaný spoločnosťou OKB „Spectr“.

Priebeh merania: 0,5 ml filtrovaného moču a 1,5 ml 3% roztoku kyseliny sulfosalicylovej sa pridalo do kremennej kyvety s dĺžkou optickej dráhy 1 cm a miešalo sa. Po 10 minútach sa merala optická hustota na spektrofotometri pri vlnovej dĺžke 595 nm oproti slepej vzorke (kyveta s 0,5 ml moču a 1,5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného). Výpočet koncentrácie proteínu sa uskutočnil podľa kalibračného plánu. Na jeho konštrukciu sa riedia štandardný roztok ľudského sérového albumínu v 0,9% roztoku chloridu sodného s koncentráciami: 0,025; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 g / l. Pre každý z pripravených roztokov sa meranie uskutočnilo rovnakým spôsobom ako pri vzorke moču. Kalibračný graf je znázornený na obr.

Obr. 1. Kalibračná krivka na stanovenie proteínu v moči sulfosalicylovou metódou.

Použila sa komerčná súprava vyrobená spoločnosťou Biocon Diagnostik (Nemecko) - Fluitest USP - Protein, ultracitlivá metóda založená na komplexe červeného pyrogallol-molybdátu.

Činidlá: pyrogallol červená, 0,06 mmol / l, molybdénan sodný, 0,04 mmol / l, sukcinátový pufor 50 mmol / l, pH 2,5, detergenty 2%; Kalibrátor (kalibračný roztok sérového albumínu, 50 g / l, v roztoku chloridu sodného, ​​0,9% a azidu sodného, ​​0,095%) zo súpravy „Uni-Test - Total Protein“ vyrobenej v „Diakon DS“ podľa poradia „A / O Unimed ”. [3].

Vybavenie: biochemický fotometer StatFax 1904 Plus ("Awareness Technology inc.", USA).

Kalibračná krivka pre opísanú metódu s pomerom vzorka / činidlo - 1 / 12,5 bola získaná použitím špeciálne pripravených roztokov sérového albumínu: 0,05; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0 g / l zriedením kalibrátora (50 g / l) 0,9% roztokom chloridu sodného (obr. 2).

Obr. 2. Kalibračná krivka pre pyrogallolovú červenú metódu, Fluitest USP činidlo, Biocon Diagnostik (Nemecko) s pomerom vzorka / činidlo 1 / 12,5.

Z každého roztoku proteínu sa odobralo 80 ul a zmiešalo sa s 1,0 ml činidla; merané ako vzorky moču.

Obr. 3. Schéma porovnateľnosti výsledkov merania obsahu proteínov vo vzorkách moču metódami sulfosalicylovej a pyrogalolu.

Kalibračná krivka pre činidlo vyrobené Unimed A / O a Biocon Diagnostik s pomerom vzorka / činidlo 1/30 bola získaná použitím špeciálne pripravených roztokov sérového albumínu: 0,05; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0, 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,75; 1,8; 1,85; 1,9; 2,0 g / l zriedením kalibrátora (50 g / l) 0,9% roztokom chloridu sodného (Obr. 4).

Obr. 4. Kalibračné krivky pre Unimed A / O činidlo (horný graf) a Fluitest USP kit od Biocon Diagnostik (dolný graf) s pomerom vzorka / činidlo 1/30.

Z každého roztoku proteínu sa odobralo 50 ul a zmiešalo sa s 1,5 ml činidla a meralo sa ako vzorky moču.

V štúdii sa na dosiahnutie maximálnej citlivosti pyrogallolovej metódy použil modifikovaný vysoko citlivý variant. Na tento účel sa zvýšil objem pridaného moču. Priebeh merania: 1 ml hlavného činidla sa pridal do všetkých skúmaviek, potom sa do prvej skúmavky pridalo 80 μl destilovanej vody (slepá vzorka), ku zvyšným skúmavkám sa pridalo 80 μl odstredenej moču, inkubovalo sa pri laboratórnej teplote počas 10 minút a optická hustota vzorky sa merala oproti slepému pokusu. 600 nm vlnovej dĺžky a 650 nm diferenciálneho filtra

Na porovnanie metód stanovenia koncentrácie proteínu v moči sa meralo 60 vzoriek moču pacientov metódou sulfoalicyl a pyrogallol.

Citlivosť metód na meranie proteínu v moči bola hodnotená skúmaním pripravených vodných roztokov moču obsahujúcich nízke koncentrácie sérového albumínu (od 0 do 0,05 g / l). Pre pyrogallolové a sulfosalicylové metódy sme tiež skúmali hodnoty nešpecifickej absorpcie v dôsledku farby vzorky moču. Na tento účel sa merala optická hustota vzoriek moču, v ktorej sa namiesto kyseliny sulfosalicylovej alebo pyrogallolového činidla pridalo ekvivalentné množstvo fyziologického roztoku.

Na vyhodnotenie účinku matrice (moču) na výsledky sulfosalicylovej metódy sa uskutočnili nasledujúce experimenty.

1) Vo vzorkách moču, ktoré neobsahujú proteín, podľa pyrogallolových a sulfosalicylových metód (n = 43) bol pridaný ľudský sérový albumín v konečnej koncentrácii 0,4 g / l. Potom sa použitím vyššie uvedených metód stanovila koncentrácia proteínu v pripravených vzorkách.

2) Vzorky moču (n = 16), ktoré majú proteín podľa pyrogallolovej metódy, boli dvakrát zriedené 0,9% roztokom chloridu sodného. Získané vzorky boli znovu vyšetrené sulfosalicylovou metódou, koncentrácia proteínu bola prepočítaná na riedenie.

Výsledky výskumu a diskusia

Štúdia vzoriek moču obsahujúcich špecifické koncentrácie albumínu ukázala, že minimálna zistiteľná koncentrácia albumínu (citlivosť metódy) bola 0,033 g / l pre sulfosalicylovú metódu a 0,012 g / l pre pyrogallolovú metódu.

Výsledky meraní vo forme diagramu porovnateľnosti výsledkov merania obsahu bielkovín vo vzorkách moču metódami sulfosalicyl (os y) a pyrogallolom (os osi x) sú znázornené na obr. 3. Pevná šikmá čiara na grafe zodpovedá rovnosti výsledkov merania dvoma spôsobmi. Ak by obe metódy dávali podobné hodnoty, potom by body na grafe museli byť zoskupené v blízkosti plnej čiary. Údaje znázornené na obr. 3, môžeme tiež poznamenať, že sulfosalicylová metóda konzistentne vykazovala nižšie koncentrácie proteínov vo všetkých vzorkách moču v porovnaní s pyrogallolovou metódou.

Ako ukázala štúdia, medzi výsledkami získanými pomocou sulfosalicylovej a pyrogallolovej metódy neexistuje žiadne presvedčivé štatistické spojenie. Okrem toho v porovnaní s pyrogallolovou metódou vykazovala sulfosalicylová metóda v 95% vzoriek moču nižšie koncentrácie proteínov. Zároveň v 86% prípadov meranie sulfosalicylovou metódou malo v porovnaní s pyrogallolovou metódou dvoj- až viackrát podhodnotené výsledky.

Metóda sulfosalicylovej v niektorých prípadoch súčasne ukázala prítomnosť proteínu vo vzorke v dôsledku tmavej farby alebo zvýšeného zákalu študovaného moču. Bolo zistené, že pri určovaní proteínu sulfosalicylovou metódou (pomer vzorky / činidla = 1/3) pri vlnovej dĺžke 595 nm, môže byť podiel vzorky moču v dôsledku jej farby alebo zákalu na výsledku od 0 do 0,247 g / l (priemerná hodnota - priemerná hodnota - priemerná hodnota: 0,031 g / l). Malo by sa teda uznať, že pri použití sulfosalicylovej metódy je použitie kontrolnej vzorky (vzorka moču + ​​fyziologický roztok) pre každú vzorku moču povinné. Pri stanovení proteínu metódou pyrogallolu neovplyvnila farba alebo stupeň zákalu vzorky moču výsledok.

Experiment na hodnotenie účinku matrice (moču) ukázal, že v takmer všetkých pripravených vzorkách moču obsahujúcich 0,4 g / l albumínu bola jeho koncentrácia stanovená sulfo-salicylovou metódou v priemere o 0,4 g / l v priemere o 20% (hraničné hodnoty koncentrácia proteínu 0,29-0,34 g / l). Súčasne pri meraní koncentrácie proteínu v týchto vzorkách metódou pyrogalolu boli výsledky pre všetky vzorky v rozsahu 0,40 až 0,46 g / l. Tiež pri hodnotení účinku matrice (moču) na výsledky merania koncentrácie proteínu sulfosalicylovou metódou sa zistilo, že v 5 zo 16 vzoriek dvakrát zriedených moču bola koncentrácia proteínov o 15–33% vyššia ako v odpovedajúcich neriedených vzorkách. Pre konečné objasnenie účinku matrice na výsledky sulfosalicylovej metódy je potrebný výskum veľkého počtu vzoriek moču.

Získané údaje teda ukazujú výhody pyrogallolovej metódy oproti sulfosalicylovej metóde v dôsledku jej vyššej citlivosti a necitlivosti na interferujúce faktory, bez potreby slepej vzorky moču, možnosti použitia jedného štandardu na vytvorenie kalibračnej krivky a malého množstva moču na analýzu. Prítomnosť takýchto vlastností nám umožňuje odporučiť pyrogallolovú metódu pre široké použitie v laboratórnej praxi.

Zo získaných údajov vyplýva záver: výsledky merania koncentrácie proteínu v moči sulfosalicylovou metódou nie sú porovnateľné s výsledkami získanými pyrogallolovou metódou. Táto skutočnosť je odpoveďou na otázku - prečo laboratóriá vyspelých krajín nepoužívajú sulfosalicylovú metódu. Aplikácia tejto metódy v zaostalých krajinách sa zrejme vysvetľuje skutočnosťou, že cenový faktor prevláda nad presnosťou a diagnostickým významom získaných výsledkov a vzhľadom na čísla uvedené na obr. 3 výsledky, možno povedať, a nad zdravým rozumom. Kto potrebuje takúto analýzu, keď pri koncentrácii proteínu v moči 0,3 g / l môže byť výsledok merania od 0,05 do 0,25 g / l? Pokiaľ ide o cenový faktor, potom, ako viete, biedny dvakrát platí. Chybné výsledky analýzy vedú k chybnej diagnóze a neúčinnej liečbe pacienta. Hlavným nebezpečenstvom použitia sulfosalicylovej metódy je, že dostávame významne podhodnotené hodnoty a nie zriedkavo chýbajú proteinúriu. Preto sa táto metóda nemôže použiť ani na skríning.

Čo teda meriame sulfosalicylovou metódou? Metóda patrí do triedy turbidimetrických, na základe merania zmeny priepustnosti svetla (DD) reakčnej zmesi v dôsledku rozptylu svetla (turbidita). V prípade detekcie proteínu v moči vzniká zákal v dôsledku nasledujúceho procesu: molekuly močových proteínov v kyslom médiu sa denaturujú, pohybujú sa od kompaktnej globulárnej formy do voľnej "vláknitej" formy. Zároveň sa výrazne zvyšuje schopnosť tvorby konglomerátu (zrážacia reakcia) v proteínoch. Jednotlivé proteínové molekuly sú menšie ako vlnová dĺžka viditeľného svetla a preto ich veľmi slabo rozptyľujú. Účinnosť rozptylu sa dramaticky zvyšuje, keď sa veľkosť výsledných konglomerátov proteínových molekúl približuje hodnote 0,6 μm (vlnová dĺžka snímacieho svetla). Čím vyššia je koncentrácia proteínu v moči, tým väčší je počet takýchto konglomerátov (centier rozptylu). Vzťah medzi optickou hustotou D D meranou na fotometri a koncentráciou proteínu v moči je však veľmi zložitý. V počiatočnom štádiu reakcie sa vytvorí určité množstvo malých proteínových častíc, potom sa začnú zlepovať do väčších častíc, zatiaľ čo koncentrácia centier rozptylu klesá a účinnosť (prierez) rozptylu každého centra sa zvyšuje. V danom čase máme v reakčnej zmesi určitý počet centier rozptylu s rôznymi veľkosťami. Pri vysokých koncentráciách proteínu v moči sa môžu tvoriť veľké proteínové častice, ktoré precipitujú, čo vedie k zníženiu optickej hustoty reakčnej zmesi.

Proces denaturácie proteínov a reakcia zrážania závisí od zloženia média, v ktorom sa vyskytujú (pH, koncentrácia rôznych solí). Na kalibráciu metódy používame vodný roztok ľudského albumínu s prídavkom 0,9% chloridu sodného. Keď meriame koncentráciu proteínu v moči, nepoznáme a neberieme do úvahy ani pH moču ani jeho zloženie soli. Tiež neberieme do úvahy skutočnosť, že v roztoku kyseliny sulfosalicylovej reagujú rôzne proteíny odlišne. To vysvetľuje veľký rozptyl výsledkov merania uvedených na obr. 3. Čím bližšie je zloženie moču k zloženiu kalibrátora, tým presnejší je výsledok merania. Existuje však veľmi málo takýchto vzoriek moču. Vo väčšine prípadov je zloženie moču také, že výsledky merania sú podhodnotené a často dosť významné.

Toto je potvrdené experimentom opísaným vyššie, v ktorom bola koncentrácia proteínu meraná sulfosalicylovou metódou v neriedených a dvojnásobne zriedených vzorkách moču. Z porovnania získaných údajov vyplynulo, že zriedenie moču (s prihliadnutím na stupeň zriedenia) vedie k zvýšeniu výsledkov merania koncentrácie proteínov o 15 - 33%. Táto skutočnosť potvrdzuje významný vplyv zloženia moču na výsledok stanovenia koncentrácie proteínu (matricový efekt).

Prečo pyrogallolová metóda umožňuje získať presnejšie výsledky merania koncentrácie bielkovín v moči? Po prvé, kvôli väčšej rôznorodosti riedenia vzoriek moču v reakčnej zmesi. Ak je v metóde sulfosalicylovej pomer vzorky moču / činidla 1/3, potom v metóde pyrogalolu môže byť v rozsahu od 1 / 12,5 do 1/60, v závislosti od variantu techniky, čo významne znižuje účinok zloženia moču na výsledok merania. Po druhé, reakcia prebieha v sukcinátovom pufri, to znamená pri stabilnom pH. A nakoniec, samotný princíp metódy, ak sa dá povedať, je transparentnejší. Molybdénan sodný a pyrogallolové červené farbivo tvoria komplex s molekulou proteínu. To vedie k tomu, že molekuly farbiva vo voľnom stave neabsorbujú svetlo pri vlnovej dĺžke 600 nm, v kombinácii s proteínom, absorbujú svetlo. Zdá sa teda, že každú molekulu proteínu označujeme farbivom, a preto zistíme, že zmena optickej hustoty reakčnej zmesi pri vlnovej dĺžke 600 nm jednoznačne súvisí s koncentráciou proteínu v moči.

Záverom, najvýznamnejšie rozdiely medzi sulfosalicylovou metódou na stanovenie proteínu v moči a metódou používajúcou pyrogallolové červené farbivo sú uvedené v tabuľke č.

Tab. Č. 1. Porovnávacie charakteristiky dvoch metód na stanovenie proteínu v moči (sulfosalicylová a pyrogallolová metóda) t

Stanovenie bielkovín moču s pyrogallolom červenej

Princíp metódy je založený na fotometrickom meraní optickej hustoty roztoku farebného komplexu vytvoreného interakciou proteínových molekúl s komplexom pyrogallol červeného farbiva a molybdénanu sodného (komplex Pyrogallol Red-Molybdate) v kyslom médiu. Intenzita farby roztoku je úmerná obsahu proteínu v skúmanom materiáli. Prítomnosť detergentov v činidle poskytuje ekvivalentnú definíciu proteínov rôznej povahy a štruktúry.

Činidiel. 1) 1,5 mmol / l roztoku pyrogalolovej červene (PGA): 60 mg PGA sa rozpustí v 100 ml metanolu. Skladujte pri teplote 0–5 ° C; 2) 50 mmol / 1 roztok jantárového pufra pH 2,5: 5,9 g kyseliny jantárovej (HOOC-CH.)₂CH₂COOH); 0,14 g oxalátu sodného (Na₂C₂O₄) a 0,5 g benzoátu sodného (C.)₆H₅COONa) sa rozpustí v 900 ml destilovanej vody; 3) 10 mmol / l roztoku kryštalickej soli molybdénanu sodného (Na₂MoO₄ × 2H₂O): 240 mg molybdénanu sodného sa rozpustí v 100 ml destilovanej vody; 4) Pracovné činidlo: do 900 ml tlmivého roztoku sukcinátu sa pridá 40 ml roztoku PHC a 4 ml roztoku molybdénanu sodného. PH roztoku sa upraví na 2,5 pomocou 0,1 mol / l roztoku kyseliny chlorovodíkovej (HCl) a jeho objem sa upraví na 1 1. Činidlo v tejto forme je pripravené na použitie a je stabilné, keď sa skladuje na tmavom mieste a pri teplote 2 - 25 ° C počas 6 mesiacov; 5) 0,5 g / l štandardného roztoku albumínu.

Priebeh odhodlania. Do prvej testovacej skúmavky sa zavedie 0,05 ml študovaného moču, do druhej skúmavky sa pridá 0,05 ml štandardného roztoku albumínu a do tretej skúmavky (kontrolná vzorka) sa pridá 0,05 ml destilovanej vody a potom sa do týchto skúmaviek pridajú 3 ml pracovného činidla. Obsah skúmaviek sa zmieša a po 10 minútach sa vzorka a štandard fotometricky odmeria proti kontrolnej vzorke pri vlnovej dĺžke 596 nm v kyvete s dĺžkou optickej dráhy 10 mm.

Výpočet koncentrácie proteínu v analyzovanej vzorke moču sa vykonáva podľa vzorca: t

kde C je koncentrácia proteínu v analyzovanej vzorke moču, g / l;_atď. a_článok- extinkciu skúmanej vzorky moču a štandardného roztoku albumínu, g / l; 0,5 - koncentrácia štandardného roztoku albumínu, g / l.

• farba roztoku (farebný komplex) je stabilná počas jednej hodiny;
• priamo úmerný vzťah medzi koncentráciou proteínu vo vzorke a absorpciou roztoku závisí od typu fotometra;
• keď je obsah proteínu v moči vyšší ako 3 g / l, vzorka sa zriedi izotonickým roztokom chloridu sodného (9 g / l) a stanovenie sa opakuje. Pri stanovovaní koncentrácie proteínu sa berie do úvahy stupeň zriedenia.

Liečime pečeň

Liečba, príznaky, lieky

Stanovenie bielkoviny pyrogallolom v moči

26.02.2009

Kurilyak O.A., Ph.D.

Normálne sa proteín vylučuje močom v relatívne malom množstve, zvyčajne nie viac ako 100 - 150 mg / deň.

Denná diuréza u zdravého človeka je 1000-1500 ml / deň; koncentrácia proteínu vo fyziologických podmienkach je teda 8 - 10 mg / dl (0,08 - 0,1 g / l).

Proteíny celkového moču predstavujú tri hlavné frakcie - albumín, mukoproteíny a globulíny.

Albumín moču je podiel sérového albumínu, ktorý bol filtrovaný v glomeruloch a nebol reabsorbovaný v renálnych tubuloch; v normálnom vylučovaní albumínu v moči je menej ako 30 mg / deň. Ďalším hlavným zdrojom proteínu v moči sú renálne tubuly, najmä distálna časť tubulov. Tieto tubuly vylučujú dve tretiny celkového množstva močového proteínu; Z tohto množstva predstavuje približne 50% glykoproteín Tamm-Horsfall, ktorý je vylučovaný epitelom distálnych tubulov a hrá dôležitú úlohu pri tvorbe močových kameňov. Iné proteíny sú prítomné v moči v malých množstvách a pochádzajú z plazmatických proteínov s nízkou molekulovou hmotnosťou filtrovaných cez renálny filter, ktoré nie sú reabsorbované v renálnych tubuloch, mikroglobulínoch z epitelu renálnych tubulov (RTE), ako aj prostatickom a vaginálnom výtoku.

Proteinúria, to znamená zvýšenie obsahu bielkovín v moči je jedným z najvýznamnejších príznakov, ktoré odrážajú poškodenie obličiek. Avšak rad ďalších stavov môže byť tiež sprevádzaný proteinúriou. Preto existujú dve hlavné skupiny proteinúrie: renálna (pravdivá) a extrarenálna (nepravá) proteinúria.

Pri renálnej proteinúrii proteín vstupuje do moču priamo z krvi kvôli zvýšeniu priepustnosti glomerulárneho filtra. Renálna proteinúria sa často vyskytuje v glomerulonefritíde, nefróze, pyelonefritíde, nefroskleróze, amyloidóze obličiek, rôznych formách nefropatie, napríklad pri nefropatii tehotných žien, horúčke, hypertenzii atď. Proteinúria sa môže vyskytnúť aj u zdravých ľudí po ťažkej fyzickej námahe, hypotermii a psychickom strese. U novorodencov sa v prvých týždňoch života pozoruje fyziologická proteinúria, a keď sa vyskytne asténia u detí a dospievajúcich, ortostatická proteinúria (vo vzpriamenej polohe tela) je možná v kombinácii s rýchlym rastom vo veku 7 až 18 rokov.

V prípade falošnej (extrarenálnej) proteinúrie je zdrojom bielkovín v moči prímes leukocytov, erytrocytov, epitelových buniek urotelia močového traktu. Rozpad týchto prvkov, obzvlášť výrazný alkalickým močom, vedie k prenikaniu proteínu do moču, ktorý už prešiel cez renálny filter. Obzvlášť vysoký stupeň falošnej proteinúrie poskytuje krv v moči, s bohatou hematuriou, môže dosiahnuť 30 g / l a viac. Ochorenia, ktoré môžu byť sprevádzané extrarenálnou proteinúriou - urolitiázou, tuberkulózou obličiek, nádormi obličiek alebo močových ciest, cystitídou, pyelitídou, prostatitídou, uretritídou, vulvovaginitídou.

Klinická klasifikácia zahŕňa miernu proteinúriu (menej ako 0,5 g / deň.), Strednú (od 0,5 do 4 g / deň.), Alebo závažnú (viac ako 4 g / deň.).

Väčšina pacientov s ochorením obličiek, ako je akútna glomerulonefritída alebo pyelonefritída, odhaľuje miernu proteinúriu, ale pacienti s nefrotickým syndrómom zvyčajne vylučujú viac ako 4 g proteínu v moči denne.

Na kvantitatívne stanovenie proteínov sa používa široká škála metód, najmä zjednotená Brandberg-Roberts-Stolnikovova metóda, biuretová metóda, metóda kyseliny sulfosalicylovej, metódy využívajúce farbivo Coomassie blue, pyrogallol red dye, atď.

Použitie rôznych metód na stanovenie proteínu v moči viedlo k vážnemu zmätku pri interpretácii limitov normy obsahu bielkovín v moči. Pretože v laboratóriách sa najčastejšie používajú 2 metódy - s kyselinou sulfosalicylovou a pyrogallolovým červeným farbivom, uvažujeme o probléme správnosti hraníc noriem pre ne. Z hľadiska sulfosalicylovej metódy v normálnom moči by obsah proteínov nemal prekročiť 0,03 g / l, az hľadiska pyrogallolu 0,1 g / l! Rozdiely sú trojnásobné.

Nízke hodnoty normálnej koncentrácie proteínov v moči pri použití sulfosalicylovej v dôsledku nasledujúcich bodov:

• kalibračná krivka je založená na vodnom roztoku albumínu. Moč vo svojom zložení je veľmi odlišný od vody: pH, soľ, zlúčeniny s nízkou molekulovou hmotnosťou (kreatinín, močovina atď.). Ako výsledok, podľa Altshuler, Rakov a Tkachev, chyba pri určovaní bielkovín moču môže byť 3 krát alebo viac! tj správne výsledky možno dosiahnuť len v prípadoch, keď má moč veľmi nízku mernú hmotnosť a jeho zloženie a pH sa približuje k vode;
• vyššia citlivosť sulfosalicylovej metódy na albumín v porovnaní s inými proteínmi (v tom čase, ako bolo uvedené vyššie, albumín v normálnych vzorkách moču nie je vyšší ako 30% celkového močového proteínu);
• ak sa pH moču posunie na alkalickú stranu, kyselina sulfosalicylová sa neutralizuje, čo tiež spôsobí zníženie výsledkov stanovenia proteínu;
• rýchlosť sedimentácie precipitátov podlieha výrazným zmenám - pri nízkych koncentráciách proteínov sa zrážanie spomaľuje a skoré ukončenie reakcie vedie k podhodnoteniu výsledku;
• rýchlosť zrážacej reakcie v podstate závisí od miešania reakčnej zmesi. Pri vysokých koncentráciách proteínu môže silné pretrepávanie skúmavky viesť k tvorbe veľkých vločiek a ich rýchlemu zrážaniu.

Všetky vyššie uvedené znaky spôsobu vedú k významnému podceneniu koncentrácie proteínu stanovenej v moči. Stupeň nedostatočného podávania závisí silne od zloženia konkrétnej vzorky moču. Pretože spôsob sulfosalicylovej kyseliny poskytuje podhodnotenú hodnotu koncentrácie proteínov, normálny limit pre túto metódu je tiež 0,03 g / l, tiež približne trikrát nižší v porovnaní s údajmi uvedenými v zahraničných referenčných knihách o klinickej laboratórnej diagnostike.

Prevažná väčšina laboratórií v západných krajinách upustila od používania sulfosalicylovej metódy na určenie koncentrácie proteínu v moči a na tento účel aktívne používa pyrogallolovú metódu. Metóda pyrogallolu na stanovenie koncentrácie proteínu v moči a iných biologických tekutinách je založená na fotometrickom princípe merania optickej hustoty farebného komplexu tvoreného interakciou proteínových molekúl s pyrogallolovým červeným farbivom a komplexnými molekulami molybdénanu sodného (komplex Pyrogallol Red - Molybdate).

Prečo pyrogallolová metóda umožňuje získať presnejšie výsledky merania koncentrácie bielkovín v moči? Po prvé, kvôli väčšej rôznorodosti riedenia vzoriek moču v reakčnej zmesi. Ak je v metóde sulfosalicylovej pomer vzorky moču / činidla 1/3, potom v metóde pyrogalolu môže byť v rozsahu od 1 / 12,5 do 1/60, v závislosti od variantu techniky, čo významne znižuje účinok zloženia moču na výsledok merania. Po druhé, reakcia prebieha v sukcinátovom pufri, to znamená pri stabilnom pH. A nakoniec, samotný princíp metódy možno povedať, že je viac „transparentný“. Molybdénan sodný a pyrogallolové červené farbivo tvoria komplex s molekulou proteínu. To vedie k tomu, že molekuly farbiva vo voľnom stave, ktoré neabsorbujú svetlo pri vlnovej dĺžke 600 nm v kombinácii s proteínom absorbujúcim svetlo. Zdá sa teda, že označujeme každú proteínovú molekulu farbivom a výsledkom je, že zmena optickej hustoty reakčnej zmesi pri vlnovej dĺžke 600 nm jasne koreluje s koncentráciou proteínu v moči. Okrem toho, pretože afinita pyrogallolu k rôznym proteínovým frakciám je takmer rovnaká, metóda umožňuje stanovenie celkového močového proteínu. Hranica normálnych hodnôt koncentrácie bielkovín v moči je preto 0,1 g / l (uvádza sa vo všetkých moderných západných smerniciach pre klinickú a laboratórnu diagnostiku, vrátane Klinickej príručky pre laboratórne testy, upravenej N. Titsom), Porovnávacie charakteristiky pyrogallolových a sulfosalicylových metód na stanovenie proteínov v moči sú uvedené v tabuľke 1.

Na záver by som sa chcel ešte raz sústrediť na skutočnosť, že keď laboratórium vychádza zo sulfosalicylovej metódy na stanovenie proteínov moču na pyrogallolovú metódu, limit normálnych hodnôt sa výrazne zvyšuje (z 0,03 g / l na 0,1 g / l!). Tento laboratórny personál by mal určite informovať lekárov, pretože V tejto situácii môže byť diagnóza proteinúrie uskutočnená iba v prípade, keď obsah proteínu v moči presahuje 0,1 g / l.

3. Stanovenie proteínu.

Princíp metódy založené na koagulácii proteínu v moči v prítomnosti dusičnanu (alebo 20% roztoku kyseliny sulfosalicylovej).

Postup prác: do 5 kvapiek moču pridajte 1-2 kvapky kyseliny dusičnej (alebo sulfosalicylovej). V prítomnosti proteínu v moči sa objavuje zakalenie.

Tabuľka. Detekcia patologických zložiek moču.

Poznámka: v prítomnosti glukózy a proteínu v skúmanom moči sa stanoví ich kvantitatívny obsah.

Kvantitatívne stanovenie bielkoviny v moči kolorimetrickou metódou s pyrogallolom.

Princíp metódyKeď proteín interaguje s pyrogallolom a molybdénanom sodným, vytvára sa farebný komplex s intenzitou farby, ktorá je úmerná koncentrácii proteínu vo vzorke.

činidlá: Pracovný reagent - roztok červeného pyrogalolu v sukcinátovom pufri, kalibračný roztok proteínu s koncentráciou 0,50 g / l

Vzorky sa miešajú, držia sa 10 minút. pri teplote miestnosti (18-25 ° C). Merala sa optická hustota (D_op) a kalibračnú vzorku (D. t_na) proti kontrolnej vzorke pri A = 598 (578-610) nm. Farbenie je stabilné 1 hodinu.

výpočet: koncentrácia proteínu v moči (C) g / l sa vypočíta podľa vzorca:

Normálne hodnoty: až 0,094 g / l, (0,141 g / deň)

Kvantitatívne stanovenie glukózy v moči metódou glukózaoxidázy.

Princíp metódyKeď je D-glukóza oxidovaná atmosférickým kyslíkom pôsobením oxidázy glukózy, vytvára sa ekvimolárne množstvo peroxidu vodíka. Pri pôsobení peroxidázy oxid peroxid vodíka oxiduje chromogénne substráty (zmes fenolu a 4 aminoantipirínu - 4 ° C) s tvorbou farebného produktu. Intenzita farby je úmerná obsahu glukózy.

2 N₂ach₂ + fenol + 4AАП farebná zlúčenina + 4Н₂ach

Postup prác1 ml pracovného roztoku a 0,5 ml fosfátového pufra sa zavedie do dvoch skúmaviek. Do prvej skúmavky sa pridá 0,02 ml moču a do druhej sa pridá 0,02 ml kalibrátora (kalibrácia, štandardný roztok glukózy, 10 mmol / 1). Vzorky sa zmiešajú, inkubujú sa 15 minút pri teplote 37 ° C v termostate a optická hustota sa meria experimentálne (D_op) a kalibrácia (D_na) vzorky proti pracovnému činidlu pri vlnovej dĺžke 500-546 nm.

Obsah glukózy v dennom moči je určený mmol / deň vynásobením výsledku získaného objemom moču zozbieraného za deň.

Poznámka. Ak je obsah cukru v moči vyšší ako 1%, musí sa zriediť.

V súčasnosti biochemické laboratóriá používajú jednotnú expresnú metódu na analýzu moču na glukózu pomocou reaktívneho glukózového testu glukózy alebo pomocou kombinovaných testovacích prúžkov na pH, proteín, glukózu, telá ketónov a krv. Testovacie prúžky, ponorené do nádoby s močom na 1 sekundu. a porovnajte farbu na stupnici.

Lekár Hepatitída

pečene

Norm proteín v pyrogallole v moči

Zdravý človek denne produkuje 1,0-1,5 litra moču. Obsah 8 - 10 mg / dl proteínu v ňom je fyziologický jav. Denný príjem bielkovín v moči 100-150 mg by nemal spôsobiť podozrenie. Globulín, mukoproteín a albumín sú to, čo tvorí celkový proteín v moči. Veľký odtok albumínu naznačuje porušenie filtračného procesu v obličkách a nazýva sa proteinúria alebo albuminúria.

Každá látka v moči má „zdravú“ frekvenciu a ak index proteínov kolíše, môže to znamenať patológiu obličiek.

Analýza moču zahŕňa použitie prvej (rannej) dávky alebo dennú vzorku. Ten je výhodnejší na stanovenie hladiny proteinúrie, pretože obsah proteínov má výrazné denné výkyvy. Moč počas dňa sa zhromažďuje v jednej nádobe, meria sa celkový objem. Pre laboratórium, ktoré vykonáva analýzu proteínov v moči, postačuje štandardná vzorka (od 50 do 100 ml) z tejto nádoby, zvyšné množstvo sa nevyžaduje. Pre viac informácií sa vykonáva ďalší test na Zimnitsky, ktorý ukazuje, či sú ukazovatele moču za deň normálne.

Späť na obsah

Proteín v moči je u dospelých normálny a nesmie prekročiť 0,033 g / l. Zároveň denná rýchlosť nie je vyššia ako 0,05 g / l. U tehotných žien je množstvo bielkovín v dennom moči viac - 0,3 g / l. A ráno je moč rovnaký - 0,033 g / l. Štandardy proteínov sa líšia vo všeobecnej analýze moču a detí: 0,036 g / l pre rannú porciu a 0,06 g / l denne. Laboratóriá najčastejšie vykonávajú analýzu pomocou dvoch metód, ktoré ukazujú, koľko proteínovej frakcie sa nachádza v moči. Vyššie uvedené normálne hodnoty sú platné pre analýzu vykonanú s kyselinou sulfosalicylovou. Ak sa použije pyrogallolové červené farbivo, hodnoty budú trikrát odlišné.

Späť na obsah

Príčinou proteínu v moči môžu byť patologické procesy v obličkách:

• filtrácia v glomeruloch obličiek je nesprávna;
• absorpcia v proteínových tubuloch je narušená;
• Niektoré choroby majú silnú záťaž na obličky - keď je proteín v krvi zvýšený, obličky jednoducho nemajú čas ho filtrovať.

Zostávajúce dôvody sú považované za non-obličkové. Takto sa vyvíja funkčná albuminúria. Proteín v analýze moču sa objavuje pri alergických reakciách, epilepsii, zlyhaní srdca, leukémii, otrave, myelóme, chemoterapii, systémových ochoreniach. Najčastejšie bude tento ukazovateľ pri analýze pacientov prvým zvončekom hypertenznej choroby.

Zvýšenie proteínov v moči môže byť spôsobené faktormi nepatologického charakteru, preto budú potrebné ďalšie analýzy.

Kvantitatívne metódy na stanovenie proteínu v moči dávajú chyby, preto sa odporúča vykonať niekoľko analýz a potom použiť vzorec na výpočet správnej hodnoty. Obsah proteínu v moči sa meria vg / l alebo mg / l. Tieto ukazovatele proteínov umožňujú určiť úroveň proteinúrie, navrhnúť dôvod, vyhodnotiť prognózu a určiť stratégiu.

Späť na obsah

Pre plné fungovanie tela vyžaduje neustálu výmenu medzi krvou a tkanivami. Je možné len vtedy, ak je v krvných cievach určitý osmotický tlak. Proteíny krvnej plazmy udržujú takú úroveň tlaku, keď nízkomolekulárne látky ľahko prechádzajú z média s vysokou koncentráciou do média s nižšou koncentráciou. Strata proteínových molekúl vedie k uvoľneniu krvi z jej lôžka do tkaniva, ktoré je plné silného edému. Toto je prejav strednej a závažnej proteinúrie.

Počiatočné štádiá albuminúrie sú asymptomatické. Pacient venuje pozornosť len prejavom základného ochorenia, ktoré je príčinou bielkovín v moči.

Stopová proteinúria sa nazýva zvýšenie hladiny bielkovín v moči v dôsledku použitia určitých produktov.

Moč na analýzu sa zachytáva v čistej, odstredenej nádobe. Pred zberom toalety je zobrazené perineum, musíte umyť mydlom a vodou. Ženám sa odporúča zavrieť vagínu kúskom bavlny alebo tampónu, aby výtok z pošvy neovplyvnil výsledok. V predvečer je lepšie nepiť alkohol, minerálnu vodu, kávu, korenistú, slanú a jedlo, ktoré dáva moču farbu (čučoriedky, repa). Silná fyzická námaha, dlhá chôdza, stres, horúčka a potenie, nadmerná konzumácia bielkovinových potravín alebo liekov pred podaním moču vyvolávajú výskyt bielkovín v moči u úplne zdravého človeka. Tento prípustný jav sa nazýva stopová proteinúria.

Späť na obsah

Ochorenie obličiek vedúce k strate proteínov:

• Amyloidóza. Normálne bunky v obličkách sú nahradené amyloidmi (komplex proteín-sacharid), ktorý zabraňuje normálnemu fungovaniu organizmu. V proteinurickom štádiu sa amyloidy ukladajú v renálnych tkanivách a ničia nefrón a v dôsledku toho renálny filter. Proteín sa tak dostane z krvi do moču. Táto fáza môže trvať viac ako 10 rokov.
• Diabetická nefropatia. Kvôli nesprávnemu metabolizmu sacharidov a lipidov sú krvné cievy, glomeruly a tubuly v obličkách zničené. Proteín v moči je prvým príznakom predpokladanej komplikácie diabetu.
• Choroby zápalovej genézy - nefritída. Tieto lézie najčastejšie postihujú krvné cievy, glomeruly a pyelocalicálny systém, čo narúša normálny priebeh filtračného systému.
• Glomerulonefritída je vo väčšine prípadov autoimunitného charakteru. Pacient sa sťažuje na zníženie množstva moču, bolesti dolnej časti chrbta a zvýšenie tlaku. Na liečbu glomerulonefritídy odporúčame diétu, režim a farmakoterapiu.
• Pyelonefritída. V akútnom období sa vyskytujú príznaky bakteriálnej infekcie: zimnica, nevoľnosť, bolesť hlavy. Toto je infekčné ochorenie.
• Polycystická choroba obličiek.

V zdravom tele nie sú molekuly proteínov (a majú veľkú veľkosť) schopné prejsť filtračným systémom obličiek. Preto by bielkoviny v moči nemali byť. Tento ukazovateľ je rovnaký pre mužov aj ženy. Ak analýza indikuje proteinúriu, je dôležité konzultovať s lekárom z dôvodov. Špecialista odhadne, koľko je hladina proteínu zvýšená, či existuje sprievodná patológia, ako obnoviť normálne fungovanie tela. Podľa štatistík majú ženy vyššie riziko urogenitálnej choroby ako muži.

Princíp metódy založené na koagulácii proteínu v moči v prítomnosti dusičnanu (alebo 20% roztoku kyseliny sulfosalicylovej).

Postup prác: do 5 kvapiek moču pridajte 1-2 kvapky kyseliny dusičnej (alebo sulfosalicylovej). V prítomnosti proteínu v moči sa objavuje zakalenie.

Tabuľka. Detekcia patologických zložiek moču.

Poznámka: v prítomnosti glukózy a proteínu v skúmanom moči sa stanoví ich kvantitatívny obsah.

Princíp metódyKeď proteín interaguje s pyrogallolom a molybdénanom sodným, vytvára sa farebný komplex s intenzitou farby, ktorá je úmerná koncentrácii proteínu vo vzorke.

činidlá: Pracovný reagent - roztok červeného pyrogalolu v sukcinátovom pufri, kalibračný roztok proteínu s koncentráciou 0,50 g / l

Vzorky sa miešajú, držia sa 10 minút. pri teplote miestnosti (18-25 ° C). Zmerajte optickú hustotu experimentálnej (Dop) a kalibračnej vzorky (Dk) proti kontrolnej vzorke pri A = 598 (578-610) nm. Farbenie je stabilné 1 hodinu.

výpočet: koncentrácia proteínu v moči (C) g / l sa vypočíta podľa vzorca:

kde: Dop = Dk = C = g / l.

Normálne hodnoty: až 0,094 g / l, (0,141 g / deň)

Princíp metódyKeď je D-glukóza oxidovaná atmosférickým kyslíkom pôsobením oxidázy glukózy, vytvára sa ekvimolárne množstvo peroxidu vodíka. Pri pôsobení peroxidázy oxid peroxid vodíka oxiduje chromogénne substráty (zmes fenolu a 4 aminoantipirínu - 4 ° C) s tvorbou farebného produktu. Intenzita farby je úmerná obsahu glukózy.

Glukóza + O2 + H20 glukonolaktón + H202

2H202 + fenol + 4AAP sfarbená zlúčenina + 4H20

Postup prác1 ml pracovného roztoku a 0,5 ml fosfátového pufra sa zavedie do dvoch skúmaviek. Do prvej skúmavky sa pridá 0,02 ml moču a do druhej sa pridá 0,02 ml kalibrátora (kalibrácia, štandardný roztok glukózy, 10 mmol / 1). Vzorky sa zmiešajú, inkubujú sa 15 minút pri teplote 37 ° C v termostate a meria sa optická hustota experimentálnych (Dop) a kalibračných (Dk) vzoriek proti pracovnému činidlu pri vlnovej dĺžke 500-546 nm.

Výpočet: C = Dop / Dk  10 mmol / l Dop = Dk =

Obsah glukózy v dennom moči je určený mmol / deň vynásobením výsledku získaného objemom moču zozbieraného za deň.

Poznámka. Ak je obsah cukru v moči vyšší ako 1%, musí sa zriediť.

V súčasnosti biochemické laboratóriá používajú jednotnú expresnú metódu na analýzu moču na glukózu pomocou reaktívneho glukózového testu glukózy alebo pomocou kombinovaných testovacích prúžkov na pH, proteín, glukózu, telá ketónov a krv. Testovacie prúžky, ponorené do nádoby s močom na 1 sekundu. a porovnajte farbu na stupnici.

Stanovenie bielkoviny pomocou pyrogallol červeného indikátora

Princíp metódy je založený na fotometrickom meraní optickej hustoty roztoku farebného komplexu vytvoreného interakciou proteínových molekúl s komplexom pyrogallol červeného farbiva a molybdénanu sodného (komplex Pyrogallol Red-Molybdate) v kyslom médiu. Intenzita farby roztoku je úmerná obsahu proteínu v skúmanom materiáli. Prítomnosť detergentov v činidle poskytuje ekvivalentnú definíciu proteínov rôznej povahy a štruktúry.

Činidiel. 1) 1,5 mmol / l roztoku pyrogalolovej červene (PGA): 60 mg PGA sa rozpustí v 100 ml metanolu. Skladujte pri teplote 0–5 ° C; 2) 50 mmol / 1 roztok jantárového pufra pH 2,5: 5,9 g kyseliny jantárovej (HOOC-CH2-CH2-COOH); 0,14 g oxalátu sodného (Na2C204) a 0,5 g benzoátu sodného (C6H5COONa) sa rozpustí v 900 ml destilovanej vody; 3) 10 mmol / l roztoku hydratovaného kryštalického hydrátu sodného (Na2MoO4 × 2H20): 240 mg molybdénanu sodného sa rozpustí v 100 ml destilovanej vody; 4) Pracovné činidlo: do 900 ml tlmivého roztoku sukcinátu sa pridá 40 ml roztoku PHC a 4 ml roztoku molybdénanu sodného. PH roztoku sa upraví na 2,5 pomocou 0,1 mol / l roztoku kyseliny chlorovodíkovej (HCl) a jeho objem sa upraví na 1 1. Činidlo v tejto forme je pripravené na použitie a je stabilné, keď sa skladuje na tmavom mieste a pri teplote 2 - 25 ° C počas 6 mesiacov; 5) 0,5 g / l štandardného roztoku albumínu.

Priebeh odhodlania. Do prvej testovacej skúmavky sa zavedie 0,05 ml študovaného moču, do druhej skúmavky sa pridá 0,05 ml štandardného roztoku albumínu a do tretej skúmavky (kontrolná vzorka) sa pridá 0,05 ml destilovanej vody a potom sa do týchto skúmaviek pridajú 3 ml pracovného činidla. Obsah skúmaviek sa zmieša a po 10 minútach sa vzorka a štandard fotometricky odmeria proti kontrolnej vzorke pri vlnovej dĺžke 596 nm v kyvete s dĺžkou optickej dráhy 10 mm.

Výpočet koncentrácie proteínu v analyzovanej vzorke moču sa vykonáva podľa vzorca: t

C = 0,5 × Apr / Ast,

kde C je koncentrácia proteínu v analyzovanej vzorke moču, g / l; Apr a Ast - extinkcia skúmanej vzorky moču a štandardného roztoku albumínu, g / l; 0,5 - koncentrácia štandardného roztoku albumínu, g / l.

• farba roztoku (farebný komplex) je stabilná počas jednej hodiny;
• priamo úmerný vzťah medzi koncentráciou proteínu vo vzorke a absorpciou roztoku závisí od typu fotometra;
• keď je obsah proteínu v moči vyšší ako 3 g / l, vzorka sa zriedi izotonickým roztokom chloridu sodného (9 g / l) a stanovenie sa opakuje. Pri stanovovaní koncentrácie proteínu sa berie do úvahy stupeň zriedenia.

• Stanovenie močového proteínu
• Zjednotený test kyseliny sulfosalicylovej
• Unified Brandberg - Roberts - Stolnikovova metóda
• Stanovenie množstva proteínu v moči reakciou s kyselinou sulfosalicylovou
• Biuretova metóda
• Detekcia v moči proteínu Bens - Jones

Proteinúria je jav, pri ktorom sa v moči detekuje proteín, čo poukazuje na možnosť poškodenia obličiek, slúži ako faktor pri rozvoji srdcových ochorení, ciev, lymfatických ciev.

Detekcia proteínu v moči neznamená vždy ochorenie. Podobný jav je typický aj pre úplne zdravých ľudí, u ktorých je možné zistiť bielkoviny moču. Hypotermia, fyzická námaha, spotreba bielkovinových potravín vedie k vzniku bielkovín v moči, ktoré zmiznú bez akejkoľvek liečby.

V čase skríningu, 17% prakticky zdravých ľudí určuje proteín, ale len 2% z tohto počtu ľudí vykazujú pozitívny výsledok testu ako znak ochorenia obličiek.

Proteínové molekuly by nemali vstupovať do krvi. Sú životne dôležité pre telo - sú stavebným materiálom pre bunky, podieľajú sa na reakciách ako koenzýmy, hormóny, protilátky. U mužov aj žien je miera úplnej neprítomnosti proteínu v moči.

Funkcia prevencie straty proteínových molekúl organizmom sa vykonáva obličkami.

Na filtrácii moču sa podieľajú dva systémy obličiek:

1. glomeruly - nenechajte vo veľkých molekulách, ale nezachovajte albumín, globulíny - malú frakciu proteínových molekúl;
2. renálne tubuly - adsorbujú proteíny filtrované glomeruly, vracajú sa späť do obehového systému.

Albumín (asi 49%), mukoproteíny, globulíny sa nachádzajú v moči, z ktorých podiel imunoglobulínov predstavuje približne 20%.

Globulíny - srvátkové proteíny s vysokou molekulovou hmotnosťou, ktoré sa vytvárajú v imunitnom systéme av pečeni. Väčšina z nich je syntetizovaná imunitným systémom, označuje imunoglobulíny alebo protilátky.

Albumíny sú zlomkom proteínov, ktoré sa najprv objavia v moči aj pri menšom poškodení obličiek. V zdravom moči je určité množstvo albumínu, ale je nevýznamné, že sa nedá zistiť pomocou laboratórnej diagnostiky.

Nižšia prahová hodnota, ktorú možno zistiť pomocou laboratórnej diagnostiky, je 0,033 g / l. Ak sa stratí viac ako 150 mg proteínu denne, hovorí sa o proteinúrii.

Základné údaje o bielkovine moču

Choroba s miernou proteinúriou je asymptomatická. Vizuálne, moč bez bielkovín nemožno odlíšiť od moču, v ktorom je malé množstvo proteínu. Mierne penivý moč sa stáva už s vysokým stupňom proteinúrie.

Aktívne vylučovanie proteínu v moči je možné predpokladať len u pacientov so stredne ťažkým alebo ťažkým stupňom ochorenia v dôsledku výskytu edému končatín, tváre, brucha.

V počiatočných štádiách ochorenia môžu byť nepriame príznaky proteinúrie nasledovné:

• zmena farby moču;
• rastúca slabosť;
• nedostatok chuti do jedla;
• nevoľnosť, zvracanie;
• bolesť kostí;
• ospalosť, závraty;
• zvýšená teplota.

Vzhľad takýchto príznakov nemožno ignorovať, najmä počas tehotenstva. To môže znamenať miernu odchýlku od normy a môže byť príznakom vzniku preeklampsie, preeklampsie.

Kvantifikácia straty proteínov nie je ľahká úloha, aby sa dosiahol kompletnejší obraz o stave pacienta, používa sa niekoľko laboratórnych testov.

Ťažkosti pri výbere metódy na detekciu nadbytočného proteínu v moči sú vysvetlené:

• nízka koncentrácia bielkovín, pri ktorých si rozpoznávanie vyžaduje vysoko presné prístroje;
• zloženie moču, komplikuje úlohu, pretože obsahuje látky, ktoré skresľujú výsledok.

Najväčšie informácie poskytuje analýza prvej rannej časti moču, ktorá sa zozbiera po prebudení.

V predvečer analýzy musia byť splnené tieto podmienky:

• Nejedzte korenené, vyprážané, bielkovinové potraviny, alkohol;
• vylúčiť diuretikum počas 48 hodín;
• obmedziť fyzickú aktivitu;
• starostlivo dodržiavať pravidlá osobnej hygieny.

Ranný moč je najviac informatívny, pretože je dlhodobo v močovom mechúre, menej závislý od príjmu potravy.

Množstvo proteínu v moči sa môže analyzovať náhodnou časťou, ktorá sa vykonáva kedykoľvek, ale táto analýza je menej informatívna, čím vyššia je pravdepodobnosť chyby.

Na kvantifikáciu dennej straty proteínu sa vykonáva analýza celkového denného moču. Za týmto účelom, do 24 hodín zozbierané v špeciálnej plastovej nádobe všetok moč pridelený na deň. Môžete začať zbierať kedykoľvek. Hlavná podmienka - presne v deň odberu.

Kvalitatívna definícia proteinúrie je založená na denaturácii proteínu fyzikálnymi alebo chemickými faktormi. Kvalitatívne metódy sa týkajú skríningu, ktorý umožňuje stanoviť prítomnosť proteínu v moči, ale neposkytuje príležitosť na presné posúdenie stupňa proteinúrie.

Použité vzorky:

• s varom;
• kyselina sulfosalicylová;
• kyselina dusičná, činidlo Larionic vo vzorke Hellerovho kruhu.

Vzorka s kyselinou sulfosalicylovou sa uskutočňuje porovnaním kontrolnej vzorky moču so skúsenou vzorkou, do ktorej sa do moču pridá 7 až 8 kvapiek 20% kyseliny sulfosalicylovej. Záver o prítomnosti proteínu sa uskutočňuje podľa intenzity opalescenčnej turbidity, ktorá sa objavuje v skúmavke počas reakcie.

Bežnejšie sa používa Gellerov test s použitím 50% kyseliny dusičnej. Citlivosť metódy je 0,033 g / l. S takou koncentráciou proteínu v skúmavke so vzorkou moču a činidlom počas 2-3 minút po začiatku pokusu sa objaví biely prúžok nití, ktorého tvorba indikuje prítomnosť proteínu.

Semikvantitatívne metódy zahŕňajú:

• spôsob stanovenia proteínu v testovacích prúžkoch v moči;
• Brandberg-Roberts-Stolnikovova metóda.

Metóda stanovenia podľa Brandberg-Roberts-Stolnikovovej metódy je založená na Gellerovej metóde, ale umožňuje presnejšie odhadnúť množstvo proteínu. Pri uskutočňovaní testu s použitím tejto techniky niekoľko riedení moču dosahuje vzhľad vláknitého proteínového kruhu v časovom intervale 2 až 3 minúty od začiatku testu.

V praxi sa používa metóda testovacích prúžkov s naneseným farbivom brómfenolovým modrom ako indikátorom. Nevýhodou testovacích prúžkov je selektívna citlivosť na albumín, čo vedie k skresleniu výsledku v prípade zvýšenia koncentrácie globulínov alebo iných proteínov v moči.

Nevýhodou spôsobu je tiež relatívne nízka citlivosť testu na proteín. Testovacie prúžky začínajú reagovať na prítomnosť proteínu v moči pri koncentrácii proteínu vyššej ako 0,15 g / l.

Kvantitatívne metódy hodnotenia možno podmienene rozdeliť na: t

Spôsoby sú založené na vlastnostiach proteínov znižovať rozpustnosť pôsobením väzbového činidla s tvorbou slabo rozpustnej zlúčeniny.

Látky, ktoré spôsobujú väzbu proteínov, môžu byť:

• kyselina sulfosalicylová;
• kyselina trichlóroctová;
• benzetóniumchlorid.

Na základe výsledkov testov sa vyvodili závery založené na stupni zoslabenia svetelného toku vo vzorke so suspenziou v porovnaní s kontrolným. Výsledky tejto metódy nie je možné vždy pripísať spoľahlivému, pretože rozdiely v podmienkach: rýchlosť miešania reaktantov, teplota, kyslosť média.

Účinok na hodnotenie užívania liekov deň predtým, pred vykonaním testov s použitím týchto metód, sa nedá uskutočniť:

• antibiotiká;
• sulfónamidy;
• lieky obsahujúce jód.

Metóda sa vzťahuje na dostupné náklady, čo umožňuje jej široké použitie pri skríningu. Presnejšie výsledky sa však dajú získať použitím drahších kolorimetrických techník.

Citlivé metódy, ktoré presne určujú koncentráciu proteínu v moči, zahŕňajú kolorimetrické metódy.

Môžete to urobiť s vysokou presnosťou:

• biuretová reakcia;
• technika Lowry;
• Farbiace techniky, ktoré používajú farbivá, ktoré tvoria komplexy s proteínmi moču, ktoré sa líšia od vzorky vizuálne.

Kolorimetrické metódy na detekciu proteínu v moči

Metóda sa týka spoľahlivého, vysoko citlivého, umožňujúceho stanoviť v moči albumín, globulíny, paraproteíny. Používa sa ako hlavná metóda na objasnenie kontroverzných výsledkov testov, ako aj denných proteínov moču u pacientov s nefrologickými oddeleniami nemocníc.

Ešte presnejšie výsledky možno dosiahnuť Lowryho metódou, ktorá je založená na biuretovej reakcii, ako aj Folinovou reakciou, ktorá rozpoznáva tryptofán a tyrozín v molekulách proteínov.

Na elimináciu možných chýb sa vzorka moču purifikuje dialýzou z aminokyselín, kyseliny močovej. Chyby sú možné pri použití salicylátov, tetracyklínov, chlórpromazínu.

Najpresnejší spôsob stanovenia proteínu je založený na jeho vlastnosti viazať sa na farbivá, ktoré sa používajú:

• Ponceau;
• Brilantná modrá Coomassie;
• pyrogalická červená.

Počas dňa sa množstvo bielkovín vylučovaných močom mení. Na objektívnejšie posúdenie úbytku bielkovín v moči je potrebné zaviesť pojem denný proteín v moči. Táto hodnota sa meria vg / deň.

Pre rýchle stanovenie dennej bielkoviny v moči sa množstvo bielkovín a kreatinínu stanoví v jedinej časti moču, potom sa pomer proteín / kreatinín vyvodí z straty proteínu za deň podľa pomeru.

Metóda je založená na skutočnosti, že rýchlosť vylučovania kreatinínu močom je konštantná, nemení sa počas dňa. U zdravého človeka je normálny pomer bielkovín: kreatinínu v moči 0,2.

Táto metóda eliminuje možné chyby, ktoré sa môžu vyskytnúť pri zbere dennej moču.

Kvalitatívne testy častejšie ako kvantitatívne testy dávajú falošne pozitívne alebo falošne negatívne výsledky. Chyby vznikajú v súvislosti s medikáciou, stravovacími návykmi, fyzickou aktivitou v predvečer analýzy.

Dekódovanie tohto kvalitatívneho testu je dané vizuálnym posúdením zákalu v skúmavke v porovnaní s výsledkom testu s kontrolou: t

1. slabá pozitívna reakcia sa stanoví ako +;
2. pozitívne ++;
3. prudko pozitívny +++.

Gellerov kruhový test presnejšie hodnotí prítomnosť proteínu v moči, ale neumožňuje kvantifikáciu proteínu v moči. Ako pri teste kyseliny sulfosalicylovej, aj Gellerov test poskytuje len približnú predstavu o obsahu bielkovín v moči.

Metóda umožňuje kvantitatívne, ale príliš časovo náročné vyhodnotenie stupňa proteinúrie, nepresnosti, pretože pri silnom zriedení sa presnosť hodnotenia znižuje.

Na výpočet bielkoviny je potrebné znásobiť stupeň zriedenia moču o 0, 033 g / l:

Tento test nevyžaduje špeciálne podmienky, tento postup sa dá ľahko urobiť doma. Na to musíte testovací prúžok spustiť do moču na 2 minúty.

Výsledky budú vyjadrené počtom plusy na páse, ktorého dekódovanie je obsiahnuté v tabuľke:

1. Výsledky testov zodpovedajúce hodnotám do 30 mg / 100 ml zodpovedajú fyziologickej proteinúrii.
2. Hodnoty na testovacích prúžkoch 1+ a 2 ++ znamenajú významnú proteinúriu.
3. Hodnoty 3 +++, 4 ++++ sú označené patologickou proteinúriou spôsobenou ochoreniami obličiek.

Testované prúžky môžu iba približne určiť zvýšený proteín v moči. Nepoužívajú sa na presnú diagnostiku a ešte viac, takže nemôžu povedať, čo to znamená.

Nedovoľte, aby testovacie prúžky primerane hodnotili množstvo bielkovín v moči u gravidných žien. Spoľahlivejšou metódou hodnotenia je stanovenie proteínu v dennom moči.

Stanovenie proteínov moču pomocou testovacích prúžkov: t

Denná bielkovina v moči je presnejšia diagnóza hodnotenia funkčného stavu obličiek. Na tento účel musíte denne zbierať všetok moč vylučovaný obličkami.

Obsah bielkovín v moči možno zistiť pomerom proteín: kreatinín, údaje sú uvedené v tabuľke:

Platné hodnoty pre pomer proteín / kreatinín sú údaje v tabuľke:

So stratou viac ako 3,5 g proteínu za deň sa tento stav nazýva masívna proteinúria.

Ak je v moči veľa bielkovín, po 1 mesiaci sa vyžaduje opätovné vyšetrenie, potom po 3 mesiacoch podľa výsledkov, ktoré určujú, prečo je norma prekročená.

Príčiny zvýšeného množstva bielkovín v moči sú jeho zvýšená produkcia v tele a porušovanie obličiek, rozlišovanie proteinúrie:

• fyziologické - menšie odchýlky od normy sú spôsobené fyziologickými procesmi, spontánne vyriešené;
• patologické zmeny sú dôsledkom patologického procesu v obličkách alebo v iných orgánoch tela bez postupného liečenia.

Mierny nárast bielkovín je možné pozorovať s bohatou výživou proteínov, mechanickými popáleninami, poraneniami, sprevádzanými zvýšenou produkciou imunoglobulínov.

Mierna proteinúria môže byť spôsobená fyzickou námahou, psycho-emocionálnym stresom alebo užívaním určitých liekov.

Fyziologická proteinúria je zvýšenie proteínov v moči u detí v prvých dňoch po pôrode. Po týždni života sa však obsah bielkovín v moči dieťaťa považuje za odchýlku od normy a naznačuje vyvíjajúcu sa patológiu.

Ochorenie obličiek, infekčné ochorenia sú tiež niekedy sprevádzané výskytom proteínu v moči.

Takéto stavy zvyčajne zodpovedajú miernemu stupňu proteinúrie, sú prechodnými fenoménmi, rýchlo prejdú sami bez toho, aby vyžadovali špeciálnu liečbu.

Závažnejšie stavy, závažná proteinúria je zaznamenaná v prípade:

• glomerulonefritis;
• diabetes;
• ochorenia srdca;
• rakovina močového mechúra;
• mnohopočetný myelóm;
• infekcia, poškodenie liekmi, ochorenie polycystických obličiek;
• vysoký krvný tlak;
• systémový lupus erythematosus;
• Goodpastureov syndróm.

Črevná obštrukcia, zlyhanie srdca a hypertyreóza môžu spôsobiť stopy bielkovín v moči.

Odrody proteinúrie sa klasifikujú niekoľkými spôsobmi. Pre kvalitatívne hodnotenie proteínov je možné použiť Yaroshevského klasifikáciu.

Podľa systematiky Yaroshevského, vytvorenej v roku 1971, sa rozlišuje proteinúria:

1. obličiek - čo zahŕňa porušenie glomerulárnej filtrácie, uvoľňovanie proteínu z tubulov, nedostatok re-adsorpcie proteínov v tubuloch;
2. - sa vyskytuje mimo obličiek, vylučovanie hemoglobínu, proteínov, ktoré sa vyskytujú v krvi v dôsledku mnohopočetného myelómu;
3. Postrenal - vyskytuje sa v mieste močového traktu po obličkách, vylučovanie bielkovín v deštrukcii močových orgánov.

Kvantitatívne hodnotenie toho, čo sa deje, sa izoluje podmienečne stupňami proteinúrie. Treba mať na pamäti, že sa bez ťažkostí môžu ľahko dostať do ťažšieho.

Najťažšie štádium proteinúrie sa vyvíja so stratou viac ako 3 g proteínu za deň. Strata proteínu od 30 mg do 300 mg denne zodpovedá strednému štádiu alebo mikroalbumúrii. Až 30 mg proteínu v dennom moči znamená miernu proteinúriu.

Proteínová norma v moči koľko?

Normálny proteín v moči prakticky chýba (menej ako 0,002 g / l). V niektorých podmienkach sa však malé množstvo proteínu môže objaviť v moči u zdravých jedincov po požití veľkého množstva proteínových potravín, ako výsledok ochladzovania, s emocionálnym stresom, predĺženou fyzickou námahou (tzv. Pochodová proteinúria).

Výskyt významného množstva proteínu v moči (proteinúria) je patológia. Príčinou proteinúrie môže byť ochorenie obličiek (akútna a chronická glomerulonefritída, pyelonefritída, gravidná nefropatia atď.) Alebo močové cesty (zápal močového mechúra, prostaty, uretrov). Renálna proteinúria môže byť organická (glomerulárna, tubulárna a prebytok) a funkčná (febrilná proteinúria, ortostatická u adolescentov, pri prekročení dojčiat, u novorodencov). Funkčná proteinúria nie je spojená s renálnou patológiou. Denné množstvo proteínu sa líši u pacientov od 0,1 do 3,0 g alebo viac. Zloženie proteínov v moči sa stanoví elektroforézou. Vzhľad v moči Bens-Jonesovho proteínu je charakteristický pre myelóm a Waldenstromovu makroglobulinémiu, # 223; 2 mikroglobulíny v prípade poškodenia renálnych tubulov.

Normálny proteín v moči prakticky chýba (menej ako 0,002 g / l).

Hlavné príznaky ochorenia zistené v štúdii moču.

SG Špecifická hmotnosť. Zníženie špecifickej hmotnosti indikuje zníženie schopnosti obličiek koncentrovať moč a vylučovať toxíny z tela, ako je to v prípade zlyhania obličiek. Zvýšenie špecifickej hmotnosti je spojené s veľkým množstvom cukru v moči, soli. Je potrebné poznamenať, že nie je možné vyhodnotiť mernú hmotnosť len pre jeden test moču, môžu sa vyskytnúť náhodné zmeny, je potrebné znovu vykonať 1-2 krát analýzu moču.

Proteín Proteín v moči - proteinúria. Príčinou proteinúrie môže byť poškodenie samotných obličiek pri nefritíde, amyloidóze a poškodení jedmi. Proteín v moči sa môže objaviť aj v dôsledku ochorení močových ciest (pyelonefritída, cystitída, prostatitída).

Glukóza Glukóza (cukor) v moči - glykozúria - najčastejšie kvôli cukrovke. Zriedkavejšou príčinou je porážka renálnych tubulov. Je veľmi znepokojujúce, ak sa spolu s cukrom v moči zistia telieska ketónov. To sa deje s ťažkým, nevyrovnaný diabetes a je predzvesťou najťažších komplikácií diabetu - diabetická kóma.

Bilirubin, Urobilinogén Bilirubín a urobilín sa určujú v moči v rôznych formách žltačky.

Erytrocyty Erytrocyty v moči - hematuria. To sa deje buď s porážkou samotných obličiek, najčastejšie so zápalom, alebo u pacientov s chorobami močových ciest. Ak sa napríklad po nich pohybuje kameň, môže poškodiť sliznicu, v moči budú červené krvinky. Rozpadajúci sa nádor obličiek môže tiež viesť k hematurii.

Leukocyty Leukocyty v moči - leukocytúria, najčastejšie výsledkom zápalových zmien v močovom trakte u pacientov s pyelonefritídou, cystitídou. Leukocyty sú často určené zápalom ženských vonkajších pohlavných orgánov, u mužov, zápalom prostaty.

Cylindrové valce sú zvláštne mikroskopické štruktúry. Hyalínové fľaše v množstve 1-2 môžu byť u zdravého človeka. Sú tvorené v renálnych tubuloch, sú zlepené spolu s proteínovými časticami. Ale zvýšenie ich počtu, valce iných typov (granulované, erytrocyty, tuk) vždy indikujú poškodenie samotného obličkového tkaniva. Existujú valce v zápalových ochoreniach obličiek, metabolické lézie, ako je diabetes.

Informatívna metóda a jej limity. Informačný obsah všeobecného testu moču na rozpoznanie špecifických ochorení obličiek je nízky, zvyčajne si vyžaduje ďalšie, presnejšie štúdie. Výskum je však veľmi dôležitý, najmä pri vykonávaní preventívnych štúdií, pretože umožňuje identifikovať skoré príznaky ochorenia obličiek. Je tiež známe, že často sa ochorenie obličiek vyskytuje skryté a iba štúdium moču im umožňuje podozrenie a ďalšie potrebné vyšetrenie.

Vo väčšine laboratórií, pri skúmaní moču na bielkoviny, najprv použiť kvalitatívne reakcie, ktoré nedetegujú proteín v moči zdravého človeka. Ak sa proteín v moči zistí kvalitatívnymi reakciami, vykoná sa kvantitatívne (alebo semikvantitatívne) stanovenie. Súčasne sú dôležité vlastnosti použitých metód pokrývajúcich rôzne spektrum uroproteínov. Pri stanovení proteínu s použitím 3% kyseliny sulfosalicylovej sa množstvo proteínu považuje za normálne až do 0,03 g / l, zatiaľ čo pri použití metódy pyrogallolu sa limit hodnôt normálneho proteínu zvyšuje na 0,1 g / l. V tejto súvislosti je vo formulári analýzy potrebné uviesť normálnu hodnotu proteínu pre metódu použitú v laboratóriu.

Pri určovaní minimálneho množstva bielkovín sa odporúča zopakovať analýzu, v prípade pochybností by sa mala stanoviť denná strata bielkovín v moči. Bežný denný moč obsahuje bielkoviny v malých množstvách. Za fyziologických podmienok je filtrovaný proteín takmer úplne reabsorbovaný epitelom proximálnych tubulov a jeho obsah v dennom množstve moču sa líši podľa rôznych autorov od stôp do 20 50, 80 100 mg a dokonca až do 150 200 mg. Niektorí autori sa domnievajú, že denné vylučovanie bielkovín v množstve 30 50 mg / deň je pre dospelého jedinca fyziologickou normou. Iní sa domnievajú, že vylučovanie proteínov v moči by nemalo prekročiť 60 mg / m2 povrchu tela denne, okrem prvého mesiaca života, keď hodnota fyziologickej proteinúrie môže byť štyrikrát vyššia ako stanovené hodnoty.

Všeobecnou podmienkou vzniku proteínov v moči zdravého človeka je ich pomerne vysoká koncentrácia v krvi a molekulová hmotnosť nie väčšia ako 100 200 kDa.

toto nie je normou, s vašou diagnózou je to možné, ďalšia vec je, že pre nefrotický syndróm je to vlastne malý indikátor.. pozrite sa na kliniku - opuch, tlak, atď., pokračujte v predpísanej liečbe.

a napriek tomu poviem: je to normálne NIE!