Patologická proteinúria je jedným z najdôležitejších a trvalých príznakov ochorení obličiek a močových ciest. Stanovenie koncentrácie bielkovín v moči je základným a dôležitým prvkom testovania moču. Identifikácia a kvantitatívne hodnotenie proteinúrie je dôležité nielen pri diagnostike mnohých primárnych a sekundárnych ochorení obličiek, hodnotenie zmien v závažnosti proteinúrie v dynamike prináša informácie o priebehu patologického procesu, o účinnosti liečby. Detekcia bielkovín v moči, dokonca aj v stopových množstvách, by mala byť alarmujúca pre možné ochorenie obličiek alebo močových ciest a vyžaduje re-analýzu. Osobitnú pozornosť si zasluhuje nezmyselnosť výskumu moču a najmä stanovenie bielkovín v moči bez dodržania všetkých pravidiel pre jeho zber.

Všetky metódy stanovenia proteínu v moči možno rozdeliť na:

• kvalita,
• semikvantitatívny,
• Kvantitatívne.

Kvalitatívne metódy

Všetky vysoko kvalitné vzorky proteínov moču sú založené na schopnosti proteínov denaturovať vplyvom rôznych fyzikálnych a chemických faktorov. V prítomnosti proteínu vo vzorke moču sa vyskytuje buď zakalenie alebo strata vločkovitého sedimentu.

Podmienky na stanovenie proteínu v moči na základe koagulačnej reakcie:

1. Moč by mal byť kyslý. Alkalický moč sa okyslí niekoľkými (2 - 3) kvapkami kyseliny octovej (5 - 10%).
2. Moč by mal byť číry. Zákal sa eliminuje cez papierový filter. Ak zákal nezmizne, pridajte mastenec alebo spálenú magnéziu (asi 1 lyžičku na 100 ml moču), pretrepte a prefiltrujte.
3. Kvalitatívny test by sa mal vykonať v dvoch skúmavkách, z ktorých jedna je kontrola.
4. Hľadanie zákalu by malo byť na čiernom pozadí v prechádzajúcom svetle.

Kvalitatívne metódy na stanovenie proteínu v moči zahŕňajú:

Ako ukazujú mnohé štúdie, žiadny z veľkého množstva dobre známych metód pre kvalitatívne stanovenie proteínu v moči neumožňuje dosiahnuť spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky. Napriek tomu sú vo väčšine CDL v Rusku tieto metódy široko používané ako skríning - v moči s pozitívnou kvalitatívnou odozvou sa ďalej vykonáva kvantifikácia proteínov. Z kvalitatívnych reakcií sa častejšie používa Gellerov test a vzorka s kyselinou sulfosalicylovou, avšak vzorka s kyselinou sulfosalicylovou sa väčšinou považuje za najvhodnejšiu na detekciu patologickej proteinúrie. Test varu sa v súčasnosti prakticky nepoužíva kvôli jeho pracovitosti a trvanlivosti.

Semikvantitatívne metódy

Metóda Brandberg-Roberts-Stolnikov je založená na teste Gellerovho krúžku, takže pri tejto metóde sú dodržané rovnaké chyby ako pri teste Geller.

V súčasnosti sa diagnostické prúžky stále častejšie používajú na stanovenie proteínov v moči. Na semikvantitatívne stanovenie proteínu v moči na pásiku je najčastejšie používaným farbivom brómfenolová modrá v citrátovom pufri. Obsah proteínu v moči sa posudzuje podľa intenzity modrozelenej farby, ktorá sa vyvíja po kontakte reakčnej zóny s močom. Výsledok sa hodnotí vizuálne alebo pomocou analyzátorov moču. Napriek veľkej popularite a zrejmým výhodám metód suchej chémie (jednoduchosť, rýchlosť analýzy) tieto metódy analýzy moču vo všeobecnosti a najmä stanovenie proteínov nie sú bez závažných nedostatkov. Jedným z nich, ktorý vedie k skresleniu diagnostických informácií, je vyššia citlivosť indikátora bromofenolovej modrej na albumín v porovnaní s inými proteínmi. V tomto ohľade sú testovacie prúžky hlavne prispôsobené na detekciu selektívnej glomerulárnej proteinúrie, keď je takmer celý proteín moču reprezentovaný albumínom. S progresiou zmien a prechodom selektívnej glomerulárnej proteinúrie na neselektívnu (objavenie sa globulínov v moči) sa výsledky stanovenia proteínu podceňujú v porovnaní so skutočnými hodnotami. Táto skutočnosť znemožňuje použiť túto metódu na stanovenie proteínu v moči na posúdenie stavu obličiek (glomerulárneho filtra) v čase. V tubulárnej proteinúrii sa tiež podceňujú výsledky stanovenia proteínov. Stanovenie proteínu pomocou diagnostických prúžkov nie je spoľahlivým indikátorom nízkych hladín proteinúrie (väčšina v súčasnosti dostupných diagnostických prúžkov nemá schopnosť zachytávať proteín v moči v koncentrácii nižšej ako 0,15 g / l). Negatívne výsledky stanovenia proteínov na prúžkoch nevylučujú prítomnosť globulínov, hemoglobínu, uromukoidu, proteínu Bens-Jones a iných paraproteínov v moči.

Vlákna hlienu s vysokým obsahom glykoproteínov (napríklad pri zápalových procesoch v močovom trakte, pyúrii, bakteriúrii) sa môžu usadiť na indikátorovej zóne pásu a viesť k falošne pozitívnym výsledkom. Falošne pozitívne výsledky môžu byť tiež spojené s vysokou koncentráciou močoviny. Zlé osvetlenie a zlé vnímanie farieb môžu spôsobiť nepresné výsledky.

V tomto ohľade by sa používanie diagnostických prúžkov malo obmedziť na skríningové postupy a výsledky získané s ich pomocou by sa mali považovať len za indikatívne.

Kvantitatívne metódy

Správne kvantitatívne stanovenie bielkovín v moči v niektorých prípadoch nie je ľahká úloha. Ťažkosti jeho riešenia sú určené nasledujúcim počtom faktorov:

• nízky obsah bielkovín v moči zdravého človeka, často na prahu citlivosti najznámejších metód;
• prítomnosť mnohých zlúčenín v moči, ktoré môžu interferovať s priebehom chemických reakcií;
• výrazné výkyvy v obsahu a zložení proteínov v moči pri rôznych ochoreniach, ktoré sťažujú výber vhodného kalibračného materiálu.

V klinických laboratóriách sa používajú prevažne tzv. „Rutinné“ metódy na stanovenie proteínu v moči, ale nie vždy poskytujú uspokojivé výsledky.

Z hľadiska odborného analytika pracujúceho v laboratóriu musí metóda určená na kvantitatívne stanovenie bielkovín moču spĺňať tieto požiadavky: t

• majú lineárny vzťah medzi absorpciou komplexu vytvoreného v priebehu chemickej reakcie a obsahom proteínu vo vzorke v širokom rozsahu koncentrácií, čím sa zabraňuje ďalším operáciám pri príprave vzorky pre štúdiu;
• mal by byť jednoduchý, nevyžadovať vysoko kvalifikovaného pracovníka, mal by sa vykonávať s malým počtom operácií;
• majú vysokú citlivosť, analytickú spoľahlivosť pri použití malých množstiev študovaného materiálu;
• byť odolné voči rôznym faktorom (variácie v zložení vzoriek, prítomnosť liekov atď.);
• majú prijateľné náklady;
• byť ľahko prispôsobiteľné automatickým analyzátorom;
• výsledok stanovenia by nemal závisieť od zloženia proteínu vzorky moču.

Žiadny z v súčasnosti známych spôsobov kvantitatívneho stanovenia proteínov v moči nemôže plne tvrdiť, že je to "zlatý štandard".

Kvantitatívne metódy na stanovenie proteínu v moči možno rozdeliť na turbidimetrické a kolorimetrické.

Turbidimetrické metódy

Turbidimetrické metódy zahŕňajú:

• stanovenie proteínu s kyselinou sulfosalicylovou (SSC), t
• stanovenie proteínu s kyselinou trichlóroctovou (THC), t
• Stanovenie proteínu s benzetóniumchloridom.

Turbidimetrické metódy sú založené na znížení rozpustnosti proteínov v moči v dôsledku tvorby suspenzie suspendovaných častíc pod vplyvom zrážacích činidiel. Obsah proteínu v testovanej vzorke sa posudzuje buď podľa intenzity rozptylu svetla, určeného počtom častíc rozptyľujúcich svetlo (nefelometrická metóda analýzy) alebo zoslabením svetelného toku výslednou suspenziou (turbidimetrická analytická metóda).

Veľkosť rozptylu svetla v precipitačných metódach detekcie proteínu v moči závisí od mnohých faktorov: rýchlosti miešania činidiel, teploty reakčnej zmesi, pH média, prítomnosti cudzích zlúčenín, metód fotometrie. Opatrné dodržiavanie reakčných podmienok prispieva k tvorbe stabilnej suspenzie s konštantnou veľkosťou častíc a získaním relatívne reprodukovateľných výsledkov.

Niektoré liečivá ovplyvňujú výsledky turbidimetrických metód na stanovenie proteínu v moči, čo vedie k tzv. "Falošne pozitívnym" alebo "falošne negatívnym" výsledkom. Patria medzi ne niektoré antibiotiká (benzylpenicilín, kloxacilín atď.), Rádioaktívne látky obsahujúce jód, sulfa liečivá.

Turbidimetrické metódy sú slabo štandardizované, čo často vedie k chybným výsledkom, ale napriek tomu sú v súčasnosti široko používané v laboratóriách kvôli nízkej cene a dostupnosti reagencií. Najrozšírenejšou metódou v Rusku je stanovenie proteínu s kyselinou sulfosalicylovou.

Kolorimetrické metódy

Najcitlivejšie a najpresnejšie sú kolorimetrické metódy na stanovenie celkového proteínu moču na základe špecifických reakcií farebných proteínov.

Patrí medzi ne:

1. biuretická reakcia,
2. Lowryho metóda
3. metódy založené na schopnosti rôznych farbív vytvárať komplexy s proteínmi:
   • Ponceau S (Ponceau S),
   • Coomassie Brilliant Blue Coomassie Brilliant Blue
   • Pyrogallol červená.

Z hľadiska výkonného umelca, v každodennej práci laboratória s rozsiahlym výskumom, je biuretová metóda z dôvodu veľkého počtu operácií nevhodná. Metóda sa zároveň vyznačuje vysokou analytickou spoľahlivosťou, umožňuje stanovenie proteínu v širokom spektre koncentrácií a detekciu albumínu, globulínov a paraproteínov s porovnateľnou citlivosťou, v dôsledku čoho sa biuretová metóda považuje za referenciu a odporúča sa na porovnanie iných analytických metód na detekciu proteínu v moči. Biouretická metóda stanovenia proteínu v moči sa prednostne vykonáva v laboratóriách slúžiacich nefrologickým oddeleniam a používa sa v prípadoch, keď sú výsledky stanovenia s použitím iných metód sporné, ako aj stanovenie množstva dennej straty proteínov u nefrologických pacientov.

Lowryho metóda, ktorá má vyššiu citlivosť ako biuretová metóda, kombinuje biuretovú reakciu a Folinovu reakciu na aminokyseliny tyrozín a tryptofán v molekule proteínu. Napriek vysokej citlivosti táto metóda neposkytuje vždy spoľahlivé výsledky pri určovaní obsahu proteínov v moči. Dôvodom je nešpecifická interakcia Folinovho činidla s neproteínovými zložkami moču (najčastejšie aminokyseliny, kyselina močová, sacharidy). Separácia týchto a ďalších zložiek moču dialýzou alebo proteínovým zrážaním umožňuje úspešne použiť túto metódu na kvantitatívne stanovenie proteínov v moči. Niektoré lieky - salicyláty, chlórpromazín, tetracyklíny sú schopné ovplyvniť túto metódu a skresliť výsledky štúdie.

Dostatočná citlivosť, dobrá reprodukovateľnosť a ľahkosť stanovenia proteínu väzbovými farbivami spôsobujú, že tieto metódy sú sľubné, ale vysoká cena činidiel zabraňuje ich širšiemu použitiu v laboratóriách. V súčasnosti sa v Rusku stáva bežnou pyrogallolovou metódou.

Pri uskutočňovaní štúdie úrovne proteinúrie je potrebné mať na pamäti, že rôzne metódy stanovenia proteinúrie majú odlišnú citlivosť a špecificitu k mnohým proteínom v moči.

Na základe empirických údajov sa odporúča stanoviť proteín dvoma rôznymi metódami a vypočítať skutočnú hodnotu pomocou jedného z nasledujúcich vzorcov:

proteinúria = 0,4799 B + 0,5230 L;
proteinúria = 1,5484 B - 0,4825 S;
proteinúria = 0,2167 S + 0,7579 L;
proteinúria = 1,0748 P - 0,0986 B;
proteinúria = 1,0104 P - 0,0289 S;
proteinúria = 0,8959 P + 0,0845 L;

kde:
B - výsledok merania s Coomassie G-250;
L je výsledok merania s Lowryho činidlom;
P - výsledok merania pyrobalátu pyrogallolu;
S je výsledok merania kyseliny sulfosalicylovej.

Vzhľadom na výrazné kolísanie hladiny proteinúrie v rôznych časoch dňa, ako aj závislosť koncentrácie proteínov v moči na diuréze, jej odlišný obsah v jednotlivých častiach moču, je teraz bežné v patológii obličiek hodnotiť závažnosť proteinúrie dennou stratou proteínu v moči, to znamená určiť tzv. denná proteinúria. Je vyjadrená vg / deň.

Ak nie je možné zbierať denne moč, odporúča sa stanoviť koncentráciu proteínu a kreatinínu v jednej dávke moču. Keďže rýchlosť uvoľňovania kreatinínu počas dňa je pomerne konštantná a nezávisí od zmien v rýchlosti močenia, pomer koncentrácie proteínu k koncentrácii kreatinínu je konštantný. Tento pomer dobre koreluje s denným vylučovaním proteínu, a preto sa môže použiť na stanovenie závažnosti proteinúrie. Normálny pomer proteín / kreatinín by mal byť menší ako 0,2. Proteín a kreatinín sa merajú vg / l. Dôležitou výhodou spôsobu stanovenia závažnosti proteinúrie pomerom proteín-kreatinín je úplná eliminácia chýb spojených s neschopnosťou alebo neúplným odberom denného moču.

Referencie:

• V. Novoselova, M. B. Pyatigorskaya, Yu.E. Mikhailov, "Klinické aspekty detekcie a hodnotenia proteínov", Príručka vedúceho CPL, č. 1, január 2007
• A. V. Kozlov, "Proteinúria: metódy jej detekcie", prednáška, Petrohrad, SPbMAPO, 2000
• VL Emanuel, „Laboratórna diagnostika ochorenia obličiek. Syndróm moču “, - Príručka vedúceho KDL, č. 12, december 2006
• VI Pupkova, L.M. Prasolov - Stanovenie bielkovín v moči a mozgovomiechovom moku. Koltsovo, 2007
• Príručka metód klinického laboratórneho výskumu. Ed. E. A. Kost. Moskva, "Medicína", 1975

Súvisiace články

Kvantitatívne metódy na stanovenie celkového močového proteínu

Na kvantifikáciu proteínu je vhodná akákoľvek vzorka moču. Väčšina výskumníkov uprednostňuje stanovenie množstva proteínu v moči zozbieranom denne, aby sa zistila denná strata proteínu.

Sekcia: Analýza moču

Semikvantitatívne metódy na stanovenie celkového proteínu v moči

V súčasnosti sa diagnostické prúžky stále častejšie používajú na stanovenie proteínov v moči. Na semikvantitatívne stanovenie proteínu v moči na pásiku je najčastejšie používaným farbivom brómfenolová modrá v citrátovom pufri. Obsah proteínu v moči sa posudzuje podľa intenzity modrozelenej farby, ktorá sa vyvíja po kontakte reakčnej zóny s močom.

Sekcia: Analýza moču

Kvalitatívne metódy na stanovenie celkového proteínu v moči

Všetky vysoko kvalitné vzorky proteínov moču sú založené na schopnosti proteínov denaturovať vplyvom rôznych fyzikálnych a chemických faktorov. V prítomnosti proteínu vo vzorke moču sa vyskytuje buď zakalenie alebo strata vločkovitého sedimentu.

Sekcia: Analýza moču

Stanovenie proteínu moču vo vzorke s 20% kyselinou sulfosalicylovou

Vzorka s 20% kyselinou sulfosalicylovou sa týka kvalitatívnych reakcií na stanovenie proteínu v moči. Pretože je založená na koagulačnej reakcii, testovaná moč musí spĺňať určité požiadavky: byť transparentná a mať kyslú reakciu.

Sekcia: Analýza moču

Gellerov test

Gellerov kruhový test je kvalitatívna reakcia na stanovenie proteínov v moči. Pretože je založená na koagulačnej reakcii, testovaná moč musí spĺňať určité požiadavky: byť transparentná a mať kyslú reakciu.

Sekcia: Analýza moču

Metódy stanovenia proteínu v moči

Malé množstvo proteínu v dennom moči sa tiež nachádza u úplne zdravých jedincov, avšak takéto malé koncentrácie nie sú detegované v jednotlivých dávkach s použitím v súčasnosti používaných metód. Približne 70% proteínov v moči zdravého človeka predstavuje uromukoid, proteín, ktorý je produktom tkaniva obličiek; preto je podiel glomerulárneho proteínu v moči zdravých ľudí zanedbateľný a proteinúria je zvyčajne 50–150 mg / deň, pričom väčšina proteínov v moči je identická so srvátkou.

Je akceptované rozlišovať nasledujúce formy proteinúrie v závislosti od miesta pôvodu: prerenal, spojený so zvýšeným rozpadom tkanivového proteínu, ťažkou hemolýzou; obličiek v dôsledku patológie obličiek, ktoré možno rozdeliť na glomerulárne a tubulárne; postrenálne, spojené s patológiou močových ciest a najčastejšie zapríčinené zápalovým exsudáciou.

V závislosti od trvania existencie vyžarujú pretrvávajúcu proteinúriu, ktorá existuje mnoho týždňov a dokonca rokov, a prechodné, objavujúce sa periodicky, niekedy dokonca v neprítomnosti ochorenia obličiek, napríklad horúčkou a ťažkou intoxikáciou. Odporúča sa rozlišovať medzi variabilitou proteinúrie: s dennou stratou bielkovín až do 1 g - stredná, od 1 do 3 g - stredná a viac ako 3 g - výrazná.

Detekcia proteínov s relatívne veľkou molekulovou hmotnosťou v moči indikuje neprítomnosť selektivity renálneho filtra a jeho výrazné poškodenie. V týchto prípadoch sa hovorí o nízkej selektivite proteinúrie. V súčasnosti sa preto široko rozšírila definícia proteínových frakcií moču. Najpresnejšie metódy sú elektroforéza v škrobových a polyakrylamidových géloch.
Podľa výsledkov získaných týmito metódami je možné posúdiť selektivitu proteinúrie.

Väčšina kvalitatívnych a kvantitatívnych metód na stanovenie proteínu v moči je založená na jeho koagulácii v objeme moču alebo na rozhraní medzi médiom (moč a kyselina); ak existuje spôsob merania intenzity koagulácie, potom sa vzorka stane kvantitatívnou.

Test jednotnej kyseliny sulfosalicylovej:

Požadované činidlo:

20% roztok kyseliny sulfosalicylovej.

Priebeh štúdie:

V 2 skúmavkách nalejte 3 ml filtrovaného moču. Do skúmavky sa pridá 6 - 8 kvapiek činidla. Na tmavom pozadí porovnajte kontrolnú skúmavku so skúseným. Zákal v skúmavke indikuje prítomnosť proteínu, vzorka sa považuje za pozitívnu.

Ak je reakcia moču zásaditá, potom sa pred vyšetrením okyslí 2-3 kvapkami 10% vodného roztoku kyseliny octovej.

Zjednotená metóda Brandberg-Roberts-Stolnikov:

Metóda je založená na vzorke Gellerovho prstenca, ktorá spočíva v tom, že na hranici kyseliny dusičnej a moču, v prítomnosti proteínu, dochádza k jeho zrážaniu a objavuje sa biely kruh.

Požadované činidlo:

30% roztok kyseliny dusičnej (relatívna hustota 1,2) alebo činidlo Larionic.
Príprava činidla Larion: 20-30 g chloridu sodného sa rozpustí zahrievaním v 100 ml destilovanej vody, nechá sa vychladnúť, prefiltruje sa. Do 99 ml filtrátu sa naleje 1 ml koncentrovanej kyseliny dusičnej.

Priebeh štúdie:

Do skúmavky sa naleje 1 až 2 ml kyseliny dusičnej (alebo činidla s kyselinou Larionovou) a opatrne sa na stenu skúmavky nanesie rovnaké množstvo filtrovaného moču. Vzhľad tenkého bieleho kruhu na rozhraní dvoch kvapalín medzi 2. a 3. minútou indikuje prítomnosť proteínu v koncentrácii približne 0,033 g / l. Ak sa prsteň objaví skôr ako 2 minúty po vrstvení, moč by sa mal zriediť vodou a opätovne zložiť už zriedený moč. Stupeň riedenia moču sa volí v závislosti od typu kruhu, t.j. jeho šírka, kompaktnosť a čas vzhľadu. S prsteňom podobným vláknu, ktorý sa objavil skôr ako 2 minúty, sa moč zriedi 2-krát, so širokým - 4-krát, s kompaktným razom - 8-krát atď. Koncentrácia proteínu sa vypočíta vynásobením 0,033 zrieďovacou rýchlosťou a vyjadrí sa v gramoch na 1 l (g / l).

Niekedy sa získa biely krúžok, keď sú prítomné veľké množstvá urátov. Na rozdiel od proteínového kruhu je urát mierne vyšší ako hranica medzi dvoma kvapalinami a rozpúšťa sa, keď je mierne zahrievaný.

Kvantitatívne stanovenie bielkoviny v moči pomocou zákalu, tvoreného pridaním kyseliny sulfosalicylovej:

Princíp metódy:

Intenzita turbidity počas proteínovej koagulácie s kyselinou sulfosalicylovou je úmerná jeho koncentrácii.

Požadované činidlá:

1. 3% roztok kyseliny sulfosalicylovej.

2. 0,9% roztok chloridu sodného.

3. Štandardný roztok albumínu - 1% roztok (1 ml roztoku obsahujúceho 10 mg albumínu): 1 g lyofilizovaného albumínu (z ľudského alebo hovädzieho séra) sa rozpustí v malom množstve 0,9% roztoku chloridu sodného v banke s objemom 100 ml. a potom sa upraví na značku rovnakým roztokom. Činidlo sa stabilizuje pridaním 1 ml 5% roztoku azidu sodného (NaN3). Pri skladovaní v chladničke je činidlo platné 2 mesiace.

Špeciálne vybavenie - fotoelektrický kolorimeter.

Priebeh štúdie:

1,25 ml filtrovaného moču sa zavedie do skúmavky, doplní sa do 5 ml 3% roztokom kyseliny sulfosalicylovej a mieša sa. Po 5 minútach sa meria na fotoelektrickom kolorimetri pri vlnovej dĺžke 590 - 650 nm (oranžový alebo červený svetelný filter) proti kontrole v bunke s dĺžkou optickej dráhy 5 mm. Kontrolou je skúmavka, do ktorej sa k 1,25 ml filtrovaného moču pridalo až 5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného. Výpočet sa vykonáva podľa kalibračného rozvrhu, pre konštrukciu ktorých sa pripravia riedenia zo štandardného roztoku, ako je uvedené v tabuľke.

Z každého výsledného roztoku sa odoberie 1,25 ml a spracuje sa ako experimentálne vzorky.

Rektilineárna závislosť pri vytváraní kalibračného grafu je uložená do 1 g / l. Pri vyšších koncentráciách sa vzorka zriedi a zohľadní sa riedenie vo výpočte.

Falošne pozitívne výsledky možno dosiahnuť, ak sú v moči obsahujúce organický jód kontrastné látky. Preto sa test nemôže používať u osôb užívajúcich jódové prípravky; falošne pozitívny výsledok môže byť spôsobený aj prípravkami sulfanilamidu, veľkými dávkami penicilínu a vysokými koncentráciami v moči kyseliny močovej.

Metóda Biuret:

Princíp metódy:

Peptidové väzby proteínu so soľami medi v alkalickom C tvoria komplex purpurovej farby. Proteíny sa vopred vyzrážajú kyselinou trichlóroctovou.

Požadované činidlá:

1. 10% roztok kyseliny trichlóroctovej.
2. 20% roztok medi (CuSO4 ∙ 5H2O).
3. 3% roztok NaOH.

Priebeh štúdie:

Do 5 ml moču z denného množstva sa pridajú 3 ml roztoku kyseliny trichlóroctovej, odstredia sa na konštantný objem sedimentu. Supernatant sa odsaje pipetou, zrazenina sa potom rozpustí v 5 ml roztoku NaOH. K roztoku sa pridá 0,25 ml CuS04, zmes sa mieša a odstredí. Supernatant sa fotometri-zuje pri vlnovej dĺžke 540 nm v kyvete s dĺžkou optickej dráhy 10 mm proti destilovanej vode. Koncentrácia proteínu sa vypočíta z kalibračnej krivky, pričom sa do grafu vynesie koncentrácia proteínu (g / l) na osi y a optická hustota v extinkčných jednotkách na osi osi. Na základe získanej koncentrácie sa vypočíta denná strata proteínu v moči.

Používanie indikátorového papiera (pásy):

Proteín je možné detegovať pomocou indikátorového papiera (prúžky), ktorý vyrába „Albuphan“, „Ames“ (Anglicko), „Albustix“, „Boehringer“ (Nemecko), „Comburtest“ atď.

Princíp je založený na fenoméne tzv. Proteínovej chyby niektorých acidobázických ukazovateľov. Indikačná časť papiera sa nasýti tetrabromfenolovou modrou a citrátovým pufrom. Keď sa papier zvlhčí, pufer sa rozpustí a poskytne vhodné pH pre reakčnú reakciu.

Pri 3,0-3,5 aminoskupinách proteínov reagujú s indikátorom a menia svoju pôvodnú žltú farbu na zeleno-modrú, po ktorej je v porovnaní s farebnou škálou možné približne odhadnúť koncentráciu proteínu v moči. Hlavným predpokladom pre správnu činnosť indikačných prúžkov je poskytnutie pH v rozsahu 3,0 až 3,5 pre vznik reakcie.

Ak je papier v kontakte so štúdiou moču, ktorá je dlhšia ako expozícia špecifikovaná v pokynoch, citrátový pufor sa v ňom rozpustí a indikátor reaguje na skutočné pH moču, t. dáva falošne pozitívnu reakciu. Vzhľadom na to, že kapacita pufra je obmedzená, aj keď sa pokyny dodržiavajú vo vzorkách príliš alkalického moču (pH> 6,5), získajú sa falošne pozitívne výsledky a vo vzorkách moču s príliš kyslým močom (pH 6,5) s nízkou relatívnou hustotou moču a pri nízkej koncentrácii proteínu jonesu bens.

Požadované činidlá:

2 M acetátový pufor pH 4,9.

Priebeh štúdie:

Prefiltrovaný moč v množstve 4 ml sa zmieša s 1 ml pufra a zahrieva sa 15 minút vo vodnom kúpeli pri teplote 56 ° C. V prítomnosti proteínov Bens-Jones sa objaví výrazná zrazenina v priebehu 2 minút a ak je koncentrácia proteínu Bens-Jones nižšia ako 3 g / l, vzorka môže byť negatívna. V praxi je to veľmi zriedkavé, pretože koncentrácia Bens-Jonesovho proteínu v moči je značná.

S úplnou istotou možno proteín Bens-Jones detegovať imunoelektroforetickou štúdiou s použitím špecifických sér proti ťažkým a ľahkým reťazcom imunoglobulínov.

Stanovenie albumózy (proteóza):

Albumózy sú produkty štiepenia proteínov, ktorých princíp je založený na skutočnosti, že sa pri varení neskladajú, ale poskytujú pozitívnu biuretickú reakciu a sú nasýtené niektorými soľami, najmä síranom amónnym a octanom zinočnatým v kyslom médiu.

Normálna moč neobsahuje albumózu. Stopy môžu byť v normálnom moči v prípade nečistoty spermy. V patológii sa albumín môže vyskytovať v moči počas febrilných stavov, transfúzií krvi a plazmy, resorpcie exsudátov a transudátov a dezintegrácie nádorov.

Požadované činidlá:

1. Nasýtený roztok chloridu sodného.
2. Koncentrovaný roztok hydroxidu sodného.
3. Slabý roztok síranu meďnatého (takmer bezfarebný).

Priebeh štúdie:

Nasýtený roztok chloridu sodného (1/3 objemu) sa pridá do moču okysleného kyselinou octovou, varí sa a horúca kvapalina sa filtruje. Albumózy prechádzajú do filtrátu, v ktorom je ich prítomnosť určená biuretovou reakciou. K filtrátu sa pridá 1/2 objemu koncentrovaného roztoku hydroxidu sodného a niekoľkých kvapiek slabého roztoku síranu meďnatého. S pozitívnou vzorkou sa získa červeno-fialové sfarbenie.

Pri pozitívnom teste s kyselinou sulfosalicylovou sa moč zahrieva. Ak zákal zmizne a znovu sa objaví, keď sa ochladí, znamená to, že moč obsahuje albumózy alebo proteínové telo Bens-Jones.

Proteín v moči, laboratórne testy

Metódy na stanovenie proteínov v moči

Pre kliniky záleží na kvalitatívnom aj kvantitatívnom stanovení bielkovín v moči.

Kvalitatívne testy na stanovenie proteínov v moči
Navrhlo sa viac ako 100 reakcií na kvalitatívne stanovenie proteínu v moči. Väčšina z nich je založená na zrážaní proteínov fyzikálnym (zahrievaním) alebo chemickými prostriedkami. Prítomnosť proteínu je dokázaná výskytom turbidity.

Zaujímavé sú aj kolorimetrické suché vzorky.

Nižšie budú opísané len tie najdôležitejšie pre prax vzorky.

Test kyseliny sulfosalicylovej. K niekoľkým mililitrom moču sa pridá 2 - 4 kvapky 20% roztoku kyseliny sulfosalicylovej. Keď sa objaví pozitívna reakcia, objaví sa zákal. Výsledok je označený termínmi: opalescencia, slabo pozitívna, pozitívna alebo silne pozitívna reakcia. Test kyseliny sulfosalicylovej je jednou z najcitlivejších vzoriek na stanovenie proteínu v moči. Zistí, že aj najmenšie abnormálne zvýšenie bielkovín v moči. Vďaka jednoduchej technike tento test našiel široké uplatnenie.

Test s aseptolom. Aseptol je náhradou kyseliny sulfosalicylovej. Môže byť pripravený z materiálov dostupných v akomkoľvek laboratóriu (fenol a kyselina sírová). Ako činidlo sa použije 20% roztok aseptolu. Test sa vykoná nasledovne: do skúmavky obsahujúcej 2 až 3 ml moču sa pridá 0,5-1-1 ml roztoku aseptolu na dno. Ak sa biely kruh koagulovaného proteínu objaví na hranici medzi dvoma kvapalinami, vzorka je pozitívna.

Gellerov test. Pod niekoľkými mililitrami moču sa nasolia 1 až 2 ml 30% kyseliny dusičnej (merná hmotnosť 1,20). Ak sa na rozhraní oboch kvapalín vytvorí biely krúžok, vzorka je pozitívna. Reakcia je pozitívna, ak je proteín vyšší ako 3,3 mg%. Niekedy sa získa biely krúžok, keď sú prítomné veľké množstvá urátov. Na rozdiel od proteínového kruhu sa urátový kruh neobjavuje na hranici medzi týmito dvoma kvapalinami, ale mierne vyšší. Larionova navrhuje použiť namiesto 30% kyseliny dusičnej ako činidlo 1% roztok kyseliny dusičnej v nasýtenom roztoku chloridu sodného; To poskytuje veľké úspory kyseliny dusičnej.

Vzorka s zhelezystosinerodisty draslíka a kyseliny octovej. Táto reakcia umožňuje izolovať sérové ​​proteíny z nukleoalbumínu.

Rovnaké množstvo moču sa naleje do dvoch skúmaviek. V jednom z nich sa pridá niekoľko kvapiek 30% roztoku kyseliny octovej. Ak sa získa turbidita v porovnaní s kontrolnou skúmavkou, moč obsahuje nukleoalbumín. Ak sa neobjaví zakalenie, obsah oboch skúmaviek sa zmieša a opäť rozdelí na dve časti. V jednej z dvoch skúmaviek pridajte niekoľko kvapiek (nadbytok môže zmeniť pozitívnu vzorku na negatívnu) 10% roztoku žltej krvnej soli (sirup hexakyanoželezitanu draselného). V prítomnosti srvátkových proteínov sa získa turbidita.

Pri koncentrovanom moči, ktorý obsahuje veľké množstvo kyseliny močovej a urátu, by sa po predbežnom zriedení (2-3 krát) moču vodou mala vykonať vzorka s draslíkom železitým a sirupom a kyselinou octovou. V opačnom prípade sa môže vyskytnúť zákal spôsobený vysrážanou kyselinou močovou.

To je dôležité najmä pri štúdii moču u detí, ktoré obsahujú veľa kyseliny močovej a urátov.

Z ostatných kvalitatívnych vzoriek na bielkoviny v moči, na základe zrážania proteínov, našli uplatnenie: test varu, Esbach, Perdi, Roberts, Almen, Balloni, Buro, Claudius, Corso, Dome, Goodmann-Suzanne, Jolla, Exton, Kamlet, Kobuladze Liliendal-Petersen, Polacci, Pons, Spiegler, Tanre, Thiele, Brown, Tsushia, atď.

Pri výrobe vysoko kvalitných vzoriek bielkovín v moči, na základe ukladania proteínov, je potrebné dodržiavať nasledujúce všeobecné pravidlá, ktorých porušenie vedie k významným chybám v štúdii.

1. Testovaný moč musí byť kyslý. Pri alkalickej reakcii sa moč mierne okyslí kyselinou octovou. Výroba vzorky s alkalickým močom v prípadoch, keď sa kyselina použije ako činidlo, môže viesť k neutralizácii kyseliny a k negatívnemu výsledku s pozitívnou reakciou. To platí najmä pre test kyseliny sulfosalicylovej, pretože kyselina sa pridáva vo veľmi malých množstvách a môže sa ľahko neutralizovať.

2. Vyšetrený moč by mal byť transparentný.

3. Vzorky na stanovenie bielkovín v moči by sa mali vždy vykonávať v dvoch skúmavkách, z ktorých jedna slúži ako kontrola. Bez kontrolnej skúmavky sa počas reakcií nevyskytuje slabý zákal.

4. Množstvo pridanej kyseliny vo vzorkách by nemalo byť príliš veľké. Veľké množstvo kyseliny môže viesť k tvorbe rozpustného acidolbumínu a k transformácii pozitívnej vzorky na negatívnu.

Kvôli ich jednoduchej technike si kolorimetrické suché vzorky zaslúžia veľkú pozornosť. Keď sa použijú tieto vzorky, účinok proteínu na farbu indikátora v tlmivom roztoku (tzv. Indikátory proteínovej chyby). Filtračný papier naplnený tlmivým roztokom kyseliny citrónovej a bromofenolovou modrou ako indikátor sa absorbuje do moču na krátky čas. Vzorka je pozitívna, ak sa zmení na modrozelenú farbu. Porovnaním intenzity sfarbenia s normami farebného papiera je možné odvodiť približné a kvantitatívne závery. Indikátorový papier sa predáva v baleniach so zodpovedajúcimi farebnými štandardmi, ako je univerzálny indikátorový papier.

Metódy pre kvantitatívne stanovenie proteínov v moči
Na kvantitatívne stanovenie proteínov v moči bolo navrhnutých mnoho metód. Presné kvantitatívne metódy na stanovenie proteínov v biologickom materiáli nie sú široko používané pri určovaní proteínov v moči v dôsledku zložitých a časovo náročných techník. Objemové metódy sú rozšírené, najmä Esbachova metóda. Sú veľmi jednoduché, ale bohužiaľ nie sú veľmi presné. Metódy skupiny Brandberg-Stolnikov, ktoré poskytujú presnejšie výsledky ako objemové metódy, s relatívne jednoduchou technikou, sú tiež vhodné pre kliniku. V prítomnosti fotometra alebo nefelometra sú tiež vhodné nefelometrické metódy.

Esbachova metóda. Bol navrhnutý parížskym lekárom Esbachom v roku 1874. Špeciálna trubica (Esbachov albuminometer) sa naleje močom a činidlom. Rúrka je utesnená gumovou zátkou, dôkladne premiešaná (bez poranenia!) A ponechaná vo vzpriamenej polohe až do ďalšieho dňa. Oznámte rozdelenie, ktoré dosiahne stĺpec proteínovej zrazeniny. Zistené číslo ukazuje obsah proteínu. Pri Esbachovej metóde je veľmi dôležité, aby bol moč kyslý. Alkalický moč môže neutralizovať kyslé zložky činidla a zabrániť zrážaniu proteínov.

Výhody metódy: v praxi je to jednoduché a pohodlné.

Nevýhody: metóda je nepresná, výsledok sa získa po 24 - 48 hodinách.

Brandberg-Stolnikovova metóda. Vychádza z Gellerovho testu kvality. Gellerova vzorka sa môže použiť na kvantitatívne stanovenie, pretože dáva pozitívny výsledok s obsahom proteínu nad 3,3 mg%. Toto je konečná koncentrácia proteínu, pod ktorou sa vzorka stáva negatívnou.

Úprava Ehrlich a Althausen. Sovietsky vedci S. L. Ehrlich a A. Ya Altgauzen upravili metódu Brandberg-Stolnikov, pričom poukázali na možnosti zjednodušenia výskumu a úspory času pri jeho výrobe.

Prvé zjednodušenie je spojené s časom vzhľadu kruhu. Je presne určený čas jeho vystúpenia, bez toho, aby sa nevyhnutne držal druhej a tretej minúty.

Druhé zjednodušenie umožňuje stanoviť, aký druh chovu by sa mal vykonať. Autori preukázali, že požadované riedenie môže byť približne stanovené typom získaného kruhu. Rozlišujú vláknité, široké
a kompaktný krúžok.

Z nefelometrických metód si treba všimnúť Kingsberryho a Clarkovu metódu. 2,5 ml filtrovaného moču sa naleje do malého odmerného valca, ktorý sa doplní 3% vodným roztokom kyseliny sulfosalicylovej na 10 ml. Dôkladne premiešajte a po 5 minútach fotometrizujte v 1 cm kyvete so žltým filtrom s použitím vody ako kompenzačnej kvapaliny. S Pulfrichovým fotometrom zistená extinkcia, vynásobená 2,5, dáva množstvo proteínu v% o. V prípade, že index extinkcie je vyšší ako 1,0, je moč predriedený 2-krát, 4-krát alebo dokonca viac.

Aby sme mali jasnú predstavu o množstve proteínov vylučovaných močom, je potrebné určiť nielen ich koncentráciu v oddelenom porte moču, ale aj ich celkové denné množstvo. Za týmto účelom odoberte moč moču 24 hodín, zmerajte jeho objem v mililitroch a stanovte koncentráciu proteínu v časti denného moču v g%. Množstvo bielkovín vylučovaných močom v priebehu 24 hodín sa určuje v závislosti od denného množstva moču v gramoch.

Klinický význam proteínu v moči

Ľudský moč normálne obsahuje minimálne množstvo bielkovín, ktoré nemožno stanoviť bežnými kvalitatívnymi vzorkami na testovanie proteínov v moči. Vylučovanie veľkého množstva bielkovín, v ktorých sa obyčajné vysoko kvalitné vzorky bielkovín v moči stávajú pozitívnymi - abnormálny jav, nazývaný proteinúria. Proteinúria je fyziologická len u novorodencov, v prvých 4-10 dňoch po narodení. Názov albuminúria, bežne používaná, je nesprávny, pretože do moču sa vylučuje nielen albumín, ale aj iné typy proteínov (globulíny atď.).

Proteinúria, ako diagnostický symptóm, bola objavená v roku 1770 Cotuno.

Najdôležitejšia funkčná renálna proteinúria u detí je nasledovná:

1. Fyziologická proteinúria novorodenca. Vyskytuje sa u väčšiny novorodencov a nemá žiadny nepriaznivý význam. Vysvetľuje ho nezrelý renálny filter, poškodenie pri narodení alebo strata tekutín v prvých dňoch života. Fyziologická proteinúria zmizne 4-10 dní po narodení (u predčasne narodených detí neskôr). Množstvo proteínu je malé. Je to nukleoalbumín.

Neonatálna albuminúria, ktorá trvá dlho, môže byť príznakom vrodených vrások.

2. Zdvih albuminúrie. Spôsobuje ich prekročenie prahovej hodnoty normálnej dráždivosti obličkového filtra výrazným mechanickým, tepelným, chemickým, mentálnym a iným podráždením - strata tekutín u dojčiat (dehydratácia proteinúrie), studené kúpanie, bohaté potraviny bohaté na bielkoviny (alimentárna proteinúria), prehmatanie obličiek (palpitácia albuminúrie), fyzicky prepracovaný, strach, atď.

Cievny albuminúria sa objavuje ľahšie u detí v ranom veku ako u detí vo vyššom veku au dospelých, pretože obličky dojčiat a malých detí sú ľahšie podráždené. Dehydratačná albuminúria (porucha kŕmenia, hydrolabilita, toxikóza, hnačka, zvracanie) je obzvlášť častá u dojčiat.

Zdvih albuminúrie je benígny. Miznú okamžite po odstránení ich príčin. Občasné leukocyty, valce a červené krvinky sa niekedy nachádzajú v sedimente. Proteín je najčastejšie nukleoalbumín.

3. Ortostatická proteinúria. Táto podmienka je charakteristická pre deti predškolského a školského veku. Vyskytuje sa na základe vazomotorických porúch v zásobovaní krvi obličkami. Typické pre ortostatickú albuminúriu (teda jej názov) je, že sa objavuje len vtedy, keď dieťa stojí, keď je chrbtica v lordotickej polohe. V polohe na chrbte zmizne. Nukleoalbumín sa uvoľňuje. V pochybných prípadoch sa môžete uchýliť k ortostatickým skúsenostiam, ktoré spočívajú v nasledovnom: večer, jednu hodinu pred ľahnutím, dieťa vyprázdni močový mechúr; ráno, vstať z postele, znova uvoľňuje moč. Tento moč neobsahuje bielkoviny. Potom sa dieťa položí na kolená na 15-30 minút s paličkou za chrbtom, medzi lakťami oboch rúk ohnuté. Vytvára pozíciu lordózy, ktorá vedie k uvoľňovaniu proteínu, bez zmien v sedimente.

S ortostatickou albuminúriou sa môže uvoľniť 8 - 10 g proteínu denne.

Organická renálna proteinúria má veľký klinický význam medzi všetkými proteinúriami. Spôsobujú ich organické ochorenia obličiek (nefritída, nefróza, nefroskleróza). Proteinúria je jedným z najdôležitejších a najznámejších príznakov organického ochorenia obličiek.

1. Pri akútnej a chronickej glomerulonefritíde sa pravidelne vyskytuje proteinúria. Množstvo proteínu je mierne a medzi stupňom proteinúrie a závažnosťou ochorenia neexistuje žiadna paralelnosť. Na rozdiel od toho, chronická a závažnejšia nefrit sa často vyskytuje s menšími množstvami proteínu ako akútne. Po akútnej nefritíde, niekedy dlhú dobu (roky), sa zistí malé množstvo proteínu v moči, ktoré nemá patologický význam ("reziduálny albuminúria"). Nemalo by sa zabúdať, že sa môže vyskytnúť aj „nefritída bez proteinúrie“. Niekedy sa bielkovina nachádza v jednej časti moču av inom nie. Pomer albumínu ku globulínom pri akútnej nefritíde je nízky a pri chronickej nefritíde je vyšší.

2. V prípade nefrosklerózy je množstvo bielkovín v moči zanedbateľné, často sa vyskytujú formy ochorenia bez bielkovín v moči.

3. Zo všetkých ochorení obličiek sa vyskytuje nefróza s najvýraznejšou proteinúriou.

4. V prípade infekčných a toxických stavov sa nachádza tzv. Febrilná a toxická proteinúria. Ide o akútnu nefrózu, pri ktorej je množstvo proteínu malé. Táto skupina tiež zahŕňa proteinúriu v kŕčových stavoch (kŕče), hypertyreoidizmus, žltačku, invaginácie, enterokolitídu, popáleniny, ťažkú ​​anémiu atď.

5. Keď v obličkách stagnuje krv, objavuje sa takzvaná kongestívna albuminúria, ktorá je charakteristická pre kardiovaskulárnych pacientov v dekompenzačnom štádiu. To je tiež nájdené v ascites a nádory brucha.

Pri febrilnom, toxickom a kongestívnom albuminúrii je zvýšená permeabilita renálneho filtra obzvlášť výrazná. Podľa niektorých autorov sa mnohé z týchto proteinúrií vyskytujú bez organického poškodenia renálneho parenchýmu.

Extrarenálna albuminúria je zvyčajne spôsobená proteínovými nečistotami (sekréty, rozbité bunky), ktoré sú vylučované chorým močovým traktom a pohlavnými orgánmi. Často sa nachádzala extrarenálna albuminúria v dôsledku cystopielitídy (pyuria), menej často v dôsledku vulvovaginitídy, zubného kameňa a nádorov močových ciest.

Keď extrarenálna albuminúria v sedimente nájde veľké množstvo leukocytov a baktérií. Renálne elementy sa takmer nikdy nevyskytujú. Množstvo proteínu je malé. Filtrovaná alebo centrifugovaná moč zvyčajne neposkytuje pozitívnu vzorku proteínu.

U ľudí, ktorí sa zotavujú z pyelitídy, albuminúria mizne po bakteriúrii a pyurii.

Ako charakteristický fenomén treba zdôrazniť, že v ranom detstve sú organické ochorenia obličiek mimoriadne zriedkavé, preto je organická proteinúria tiež zriedkavá. Z nich sa najčastejšie vyskytujú febrilné a toxické látky. Na rozdiel od organickej proteinúrie sa u malých detí veľmi často vyskytuje albuminúria.

U starších detí je funkčná organická proteinúria. Všeobecne platí, že s vekom je funkčná proteinúria menej častá a organická častejšie.

Elektroforetické štúdie proteínov v moči

Mnohí autori používajú elektroforetickú metódu na štúdium proteínov v moči (uroproteíny). Zo získaného elektroforegramu je zrejmé, že majú rovnaké kvalitatívne zloženie ako plazmatické proteíny. To naznačuje, že proteíny v moči pochádzajú z plazmatických proteínov.

Kvalitatívne a kvantitatívne stanovenie proteínu v moči.

Normálne hodnoty: normálny proteín v moči je obsiahnutý v minimálnych množstvách, ktoré nie sú zistené bežnými kvalitatívnymi reakciami. Horná hranica normy pre bielkoviny v moči je 0,033 g / l. Ak je obsah proteínu vyšší ako táto hodnota, potom sa vzorky bielkovín vysokej kvality stanú pozitívnymi.

Klinický význam definície: t

Výskyt bielkovín v moči sa nazýva proteinúria. Proteinúria môže byť falošná a renálna. Extrarenálna proteinúria môže byť v prítomnosti nečistôt proteínového pôvodu z pohlavných orgánov (vaginitída, uretritída, atď.), Zatiaľ čo množstvo proteínu je zanedbateľné - až 0,01 g / l. Renálna proteinúria môže byť funkčná (s hypotermiou, fyzickou námahou, horúčkou) a organická - s glomerulonefritídou, pyelonefritídou, nefritídou, nefrózou, zlyhaním obličiek. Pri renálnej proteinúrii môže byť obsah proteínu od 0,033 do 10-15 g / l, niekedy vyšší.

Princíp metódy: je založený na skutočnosti, že proteín pôsobením anorganických kyselín koaguluje (stáva sa viditeľným). Stupeň zákalu závisí od množstva proteínu.

Detekcia proteínu v moči s 20% kyselinou sulfosalicylovou.

Činidlá: 20% roztok kyseliny sulfosalicylovej. Vybavenie: tmavé pozadie.

1. Požiadavky na moč: moč musí byť kyslé (alebo mierne kyslé) ​​pH, musí byť transparentné, na tento účel sa moč odstredí. Alkalický moč sa okyslí na slabo kyslé reakčné médium s použitím indikátorového papiera na kontrolu.

2. V 2 skúmavkách s rovnakým priemerom nalejte 2 ml pripraveného moču. 1 skúmavka - kontrola, 2 - skúsenosti. Do skúmavky sa pridajú 4 kvapky 20% kyseliny sulfosalicylovej.

3. Výsledok je označený na tmavom pozadí.

4. V prítomnosti proteínu rast moču v skúmavke zakalí.

Vysoko kvalitné stanovenie bielkovín v moči pomocou testovacích prúžkov.

Na identifikáciu proteinúrie sa používajú rôzne monotestové pásy: Albufan, Albustiks, Biofan E a politické testy: Triscan, Nonafan a ďalšie.

Detekcia bielkovín v moči metódou Roberts - Stolnikov.

Princíp metódy: je založený na skutočnosti, že proteín pôsobením anorganických kyselín koaguluje (stáva sa viditeľným). Stupeň zákalu závisí od množstva proteínu (t.j. Gellerovho kruhového testu). Keď je koncentrácia proteínu v moči 0,033 g / l, do konca 3 minút po vrstvení moču sa objaví tenká biela niť.

Činidlá: 50% roztok kyseliny dusičnej alebo Robertsovho činidla (98 dielov nasýteného roztoku chloridu sodného a 2 diely koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej) alebo činidla Larionic (98 dielov nasýteného roztoku chloridu sodného a 2 diely koncentrovanej kyseliny dusičnej).

Vybavenie: tmavé pozadie.

1. Požiadavky na moč: moč musí byť kyslé (alebo mierne kyslé) ​​pH, musí byť transparentné, na tento účel sa moč odstredí. Alkalický moč sa okyslí na slabo kyslé reakčné médium s použitím indikátorového papiera na kontrolu.

2. Do testovacej skúmavky nalejte 2 ml 50% roztoku kyseliny dusičnej alebo jedného z činidiel, potom opatrne nalejte rovnaký objem pripraveného moču pozdĺž steny skúmavky pipetou.

3. Vzorka sa ponechá 3 minúty

4. Po 3 minútach oznámte výsledok. Výsledok je označený na tmavom pozadí v prechádzajúcom svetle. Ak je kruh široký, kompaktný, potom sa moč zriedi destilovanou vodou a znova sa nanesie na činidlo.

5. Moč sa zriedi až po 3 minútach sa vytvorí tenký vláknitý kruh.

6. Výpočet obsahu bielkovín v moči sa vyrába podľa vzorca: t

C = 0,033 g / l x stupeň riedenia.

194.48.155.245 © studopedia.ru nie je autorom materiálov, ktoré sú zverejnené. Ale poskytuje možnosť bezplatného použitia. Existuje porušenie autorských práv? Napíšte nám Kontaktujte nás.

Zakázať adBlock!
a obnoviť stránku (F5)
veľmi potrebné

Metodický vývoj praktických hodín "Stanovenie proteínov v moči" (1 kurz) t

Kapitálové tréningové centrum
Moskva

Téma: Stanovenie proteínov v moči.

Cieľ štúdie: Štúdium chemických vlastností moču.

Študovať kvantitatívne a kvalitatívne metódy na stanovenie proteínov v moči;

Naučte sa základné princípy práce s testovacími prúžkami na automatických analyzátoroch.

Typ zamestnania: praktický (6 hodín)

Študent by mal vedieť:

Kvalitatívne vzorky na stanovenie proteínov.

Roberts - Stolnikovova metóda.

Stanovenie proteínu 3% SSC.

Biuretova metóda stanovenia proteínov (THU).

Diagnostická hodnota výskumných ukazovateľov.

Študent by mal byť schopný: t

Pripravte pracovisko na testovanie moču.

Pripravte reagencie, misky a vybavenie pre štúdiu.

Určiť chemické vlastnosti moču (proteín v moči kvalitatívnymi a kvantitatívnymi metódami).

Práca s prázdnymi výrobkami (návrh analytických formulárov).

Výsledky štúdie správne interpretujte.

Prostriedky na dosiahnutie cieľa:

1. Práca s poznámkami, pedagogickou a odbornou literatúrou.

2. Príprava praktických cvičení s využitím metodických odporúčaní učiteľa, realizácia a realizácia praktickej práce.

3. Práca s informačnými prostriedkami vzdelávania v elektronických a papierových médiách.

Zariadenia pre pracovne a kancelárske pracoviská: t

počet miest podľa počtu študentov;

pracovisko učiteľa;

špecializovaný nábytok a vybavenie.

Technické vzdelávacie nástroje:

počítače na vybavenie pracoviska učiteľa a študentov;

Technické zariadenia na audiovizuálne zobrazovanie informácií;

audiovizuálne učebné pomôcky (prezentácia, tréningové video).

Výsledkom zvládnutia hodiny je:

Vytvorenie praktických odborných zručností a počiatočných praktických skúseností, vrátane odborných (PC) a všeobecných (QA) kompetencií:

PC 1.1. Pripravte pracovisko na laboratórne klinické skúšky.

PC 1.2. Vykonávať laboratórne klinické štúdie biologických materiálov.

PC 1.3. Zaznamenajte výsledky výskumu.

PC 1.4. Použitý materiál zlikvidujte, dezinfikujte a sterilizujte použité laboratórne sklo, nástroje a ochranné pomôcky.

OK 1. Porozumieť povahe a spoločenskému významu ich budúceho povolania, prejavte na tom trvalý záujem.

OK 2. Usporiadajte si vlastné aktivity, vyberte si štandardné metódy a spôsoby vykonávania odborných úloh, hodnotte ich efektívnosť a kvalitu.

OK 6. Pracovať v tíme a tíme, efektívne komunikovať s kolegami, manažmentom, pacientmi.

OK 9. Byť vedený v podmienkach zmeny technológie v odbornej činnosti.

OK 13. Organizovať pracovisko v súlade s požiadavkami ochrany práce, priemyselnej hygieny, infekčnej a požiarnej bezpečnosti.

I modul. Teoretická časť s prvkami samostatnej práce

Číslo úlohy 1. Štúdium a prehľad študijných materiálov v zošitoch.

Zdravý človek zvyčajne obsahuje menej ako 0,002 g / l a zriedkavo až 0,012 g / l proteínu a zvyčajne sa tento obsah bielkovín v moči nazýva „vo forme stôp“ a nie je detekovaný bežnými chemickými metódami v zdravom ľudskom moči.

Obsah proteínov v porciách moču zozbieraných v rôznych časoch dňa sa môže značne líšiť.

Proteín v moči sa nazýva proteinúria.

V závislosti od dennej straty proteínu sa rozlišujú nasledujúce stupne proteinúrie: stredná až do 1 g; médium - od 1 do 3 g; výraznejšie - viac ako 3 g.

Existujú dva hlavné typy proteinúrie:

Proteinúria, spôsobená chorobami močových ciest;

proteinúria, s léziami (ochoreniami) obličiek.

Proteinúria spojená so zápalovými procesmi močového traktu, sprevádzaná výskytom významného počtu leukocytov alebo erytrocytov v moči, ktorý však neodstraňuje simultánny vstup proteínu do moču z obličkového parenchýmu; obsah proteínov zriedka presahuje 1 g / l.

Renálna proteinúria je vo väčšine prípadov spojená so zvýšenou permeabilitou glomerulov a je rozdelená do dvoch skupín:

Medzi fyziologické proteinúrie patria prípady dočasného výskytu bielkovín v moči, ktoré nie sú spojené s ochoreniami:

po konzumácii veľkého množstva potravy bohatej na nedenaturované proteíny (surové mäso, surové vajcia);

s intenzívnou svalovou prácou (dlhé túry, športové podujatia);

pri chladnom kúpeli alebo sprche;

so silnými emocionálnymi skúsenosťami;

s epileptickými záchvatmi.

Rozlišujte ortostatickú alebo mladistvú proteinúriu, ktorá sa vyskytuje u detí a dospievajúcich a prechádza vekom. V diferenciálnom - diagnostickom vzťahu je praktické, aby sa ortostatická albuminúria často vyskytovala v období zotavenia z akútnej glomerulonefritídy.

Patologická renálna proteinúria môže byť výsledkom organických ochorení obličiek a iných orgánov a systémov: akútna glomerulonefritída; chronickej glomerulonefritídy; akútna pyelonefritída; chronická pyelonefritída; nefropatia tehotných žien; rôzne choroby spojené s horúčkou; závažné chronické srdcové zlyhanie; a mierne ochorenie obličiek; lipoidnú nefrózu; tuberkulóza obličiek; hemoragické horúčky; hemoragická vaskulitída; ťažká anémia; hypertenzia atď.

Úloha číslo 2. Prepíšte a nakreslite diagramy laboratórnych metód na stanovenie proteínu v moči.

Laboratórne metódy na stanovenie bielkovín v moči

Existujú kvalitatívne a kvantitatívne metódy na stanovenie proteínu v moči, sú založené na koagulácii proteínu v objeme moču alebo na hranici média (moč a kyselina); pri meraní stupňa koagulácie je vzorka kvantitatívna.

vzorka s 20% kyselinou sulfosalicylovou (štandardizovaná);

Gellerov kruhový test (v súčasnosti sa nepoužíva);

detekcia proteínov pomocou indikátorového papiera (prúžky) a testovacích prúžkov.

jednotná metóda Brandberg-Roberts-Stolnikov;

s 3% kyselinou sulfosalicylovou.

Kvalitatívne metódy na stanovenie proteínu v moči

Úloha číslo 3. Stanovenie proteínu v moči pomocou štandardizovanej vzorky s 20% kyselinou sulfosalicylovou

Princíp metódy: je založený na koagulácii proteínu v objeme moču alebo na hranici média (moč a kyselina)

Riad, zariadenie a reagencie: t

20% kyseliny sulfosalicylovej (kyselina 2-hydroxy-5-sulfobenzoová C.) ₇ H ₅ 0 ₆ S).

3 ml filtrovaného moču

2 kusy chemické skúmavky

Tri skúmavky s filtrovaným močom sa zavedú do dvoch skúmaviek, do jednej z nich sa pridá 6 až 8 kvapiek kyseliny sulfosalicylovej. Na tmavom pozadí sa porovnávajú obe skúmavky.

Interpretácia výsledkov:

Opacifikácia v skúmavke indikuje prítomnosť proteínu v moči - vzorka je pozitívna.

Poznámka. Alkalický moč sa pred testom okyslí pridaním niekoľkých kvapiek 10% roztoku kyseliny octovej.

Číslo úlohy 4. Stanovenie proteínu pomocou Gellerovho testu

Princíp metódy: Vzorka kruhu je založená na skutočnosti, že keď sa kyselina dusičná pridáva do moču na rozhraní (kyselina - moč) v prítomnosti proteínu, koaguluje a objavuje sa biely kruh.

Riad, zariadenie a reagencie: t

- činidlá: 30% roztok kyseliny dusičnej (HNO 3) (d = 1,2) alebo Laryonický reaktant: 20 - 30 g chloridu sodného (NaCl) rozpusteného v 100 ml destilovanej vody pri zahrievaní, ochladení, prefiltrovaní; K 99 ml filtrátu sa pridá 1 ml koncentrovanej HN03.

Do skúmavky nalejte 1 - 2 ml 30% roztoku HNO 3 alebo Larionovej reagencie a jemne naneste rovnaké množstvo filtrovaného moču na stenu.

Interpretácia výsledkov:

Vzhľad na hranici dvoch kvapalín medzi 2. a 3. minútou tenkého bieleho krúžku indikuje prítomnosť proteínu v moči.

Nakreslite schému na stanovenie proteínu

Kvantifikácia proteínov

Princíp metódy: Vzorka Gellerovho prstenca je založená na skutočnosti, že keď sa kyselina dusičná pridáva do moču na rozhraní (kyselina - moč) v prítomnosti proteínu, koaguluje a objavuje sa biely kruh.

Riad, zariadenie a reagencie: t

Biologická tekutina (moč);

Do skúmavky nalejte 1 - 2 ml 30% roztoku HNO 3 alebo Larionovej reagencie a jemne naneste rovnaké množstvo filtrovaného moču na stenu.

Interpretácia výsledkov:

Vzhľad na hranici dvoch kvapalín medzi 2. a 3. minútou
tenký biely krúžok indikuje prítomnosť proteínu v koncentrácii približne 0,033 g / l. Ak sa krúžok objaví skôr ako 2 minúty po laminácii, moč by sa mal zriediť destilovanou vodou a znovu testovať so zriedeným močom. Stupeň riedenia moču sa volí v závislosti od typu kruhu, jeho šírky, kompaktnosti a času vzhľadu.

S prsteňom podobným vláknu, ktorý sa objavil skôr ako 2 minúty, sa moč zriedi 2-krát, so širokým - 4-krát, s kompaktným razom - 8-krát atď. Koncentrácia proteínu sa vypočíta vynásobením zriedenia 0,033 g / l.

Pri veľkom počte urátov sa môže vytvoriť biely krúžok; Na rozdiel od bielkovín sa objavuje mierne nad hranicou dvoch kvapalín a rozpúšťa sa, keď sa mierne zahrieva.

Číslo úlohy 6. Stanovenie množstva proteínu v moči s 3% kyselinou sulfosalicylovou

Princíp metódy: Koncentrácia proteínu v moči je úmerná zákalu, ktorý nastáva, keď koaguluje kyselinu sulfosalicylovú.

Riad, zariadenie a reagencie: t

0,9% roztok chloridu sodného;

1% štandardný roztok albumínu - 1 g lyofilizovaného albumínu (z ľudského alebo hovädzieho séra) sa rozpustí v malom množstve 0,9% roztoku chloridu sodného v banke s objemom 100 ml a potom sa doplní po značku rovnakým rozpúšťadlom. Reakčné činidlo sa stabilizuje pridaním 1 ml 5% roztoku azidu sodného (NaN3). Pri skladovaní v chladničke je činidlo stabilné 2 mesiace.

1,25 ml filtrovaného moču sa zavedie do skúmavky, pridá sa 3,75 ml 3% roztoku kyseliny sulfosalicylovej a mieša sa. Po 5 minútach sa vzorka fotometricky meria na PEC pri vlnovej dĺžke 590 - 650 nm (oranžový alebo červený svetelný filter) proti kontrole v kyvete s dĺžkou optickej dráhy 5 mm. Kontrola slúži ako vzorka, do ktorej sa pridá 1,75 ml 0,9% roztoku chloridu sodného do 1,25 ml moču. Koncentrácia proteínu sa vypočíta podľa kalibračného grafu, pri ktorom sa pripravia roztoky štandardného roztoku albumínu. (pozri tabuľku). Z každého získaného zriedeného roztoku sa odoberie 1,25 ml a spracuje sa ako experimentálne vzorky.

Príprava riedení na vynesenie kalibrácie

Štandardný roztok, ml

0,9% roztok chloridu sodného, ​​ml

Koncentrácia proteínu, g / l

Rektilinárna závislosť veľkosti extinkcie a koncentrácie proteínu sa udržiava na 1 g / l. Pri vyšších koncentráciách bielkovín sa vzorka zriedi a zohľadní sa riedenie vo výpočte.

Ak sa v moči nachádzajú látky obsahujúce jód, môžu sa získať falošne pozitívne výsledky. Preto sa test nemôže použiť u pacientov, ktorí užívajú jódové prípravky alebo ktorí podstúpili výskum s použitím rádioaktívnych látok obsahujúcich jód. Falošne pozitívne J reakcie počas štúdie môžu byť spôsobené užívaním sulfanilamidových liekov, veľkých dávok penicilínu a vo vysokých koncentráciách v moči kyseliny močovej.

Nakreslite schému na stanovenie proteínu

Číslo úlohy 7. Detekcia Bens-Jones v moči

Princíp metódy: založený na reakčnej termoprecipitácii

Riad, zariadenie a reagencie: t

Činidlo: 2M acetátový pufor pH 4,9.

4 ml filtrovaného moču sa zmieša s 1 ml tlmivého roztoku a zahrieva sa 15 minút vo vodnom kúpeli na 56 ° C.

Interpretácia výsledkov:

V prítomnosti proteínu Bens-Jones v moči sa v prvých 2 minútach objavuje výrazný sediment.

Keď je koncentrácia proteínu nižšia ako 3 g / l, vzorka môže byť negatívna, čo je dosť zriedkavé, pretože koncentrácia proteínu Bens-Jones v moči je veľmi významná.

Najspoľahlivejšou detekciou proteínu Bens-Jones je zrážanie pri teplote 40-60 ° C. Avšak pri príliš kyslom (pH menej ako 3,0) alebo príliš alkalickom (pH viac ako 6,5) moči, s nízkou relatívnou hustotou moču a nízkou koncentráciou Bens-Jonesovej béžovej farby (menej ako 3 g / l) sa sedimentácia nemusí vyskytnúť.

Nakreslite schému na stanovenie proteínu

II modul. Nezávislá práca s výskumnou fázou

Číslo úlohy 1. Štúdia a náčrt aplikácie №1 "Detekcia proteínu pomocou diagnostických testovacích prúžkov"

- Od učiteľa získajte vzorky biologickej tekutiny (moč), počet vzoriek;

- Vykonajte test moču pomocou diagnostických testovacích prúžkov;

- Hodnotiť výsledok (norma, patológia). Predpokladajme, že príčina bielkovín v moči.

- Napíšte výsledok do formulára analýzy, odovzdajte ho učiteľovi.

"Detekcia proteínu pomocou diagnostických testovacích prúžkov"

Princíp. Proteín mení farbu indikátora aplikovaného na prúžok. Indikátory sú balené v súbore 100 prúžkov, ktoré sú uložené v tesne uzavretom puzdre na ceruzku, na chladnom a suchom mieste.

Pravidlá pre prácu s diagnostickými testovacími prúžkami

Pri práci s diagnostickými testovacími prúžkami musíte dodržiavať nasledujúce pravidlá:

- diagnostické testovacie prúžky uchovávajte v tesne uzavretých nádobách;

- skladovať veci na tmavom, suchom, chladnom mieste pri teplote nepresahujúcej 30ºС, ale nie v chladničke;

- Nevystavujte pásy vlhkosti a priamemu slnečnému žiareniu, vysokým teplotám a prchavým chemikáliám.

- získajte len nevyhnutne potrebný počet pásikov a potom kryt okamžite zatvorte;

- Nedotýkajte sa diagnostických zón prstami.

Pravidlá testovania

1. Na štúdiu používajte rannú moč zozbieranú v jednorazovom plastovom zásobníku na moč (alebo čisté suché riady). Dodávaný moč zmiešajte, ale odstred'ujte.

Pri použití neštandardne upraveného balenia zvyšky pracieho prostriedku v nádobe na zber moču spôsobujú nesprávne výsledky.

2. Z puzdra na ceruzku odoberte testovací prúžok.

3. Ihneď zatvorte kryt výrobným krytom, chráňte prúžok pred vlhkosťou.

4. Indikátorové papierové pásy spustite na 2 - 3 sekundy do vyšetrovanej moču a okamžite ich vyberte.

5. Ak chcete odstrániť prebytočnú vlhkosť z diagnostických zón pásu, spustite ju dlhým okrajom pozdĺž okraja nádoby (alebo inej nádoby, v ktorej sa dodáva moč), alebo ju pripevnite na filtračný papier.

Z diagnostických zón nie je možné vymyť prebytočný moč.

6. Po uplynutí času uvedeného na štítku nádoby alebo v pokynoch pre každú skúšku skontrolujte farbu príslušnej diagnostickej zóny s farebnou stupnicou na štítku nádoby s pruhmi (štandard). Postup skúšky je znázornený na obrázkoch 1-7.

7. Reakcia sa hodnotí ako pozitívna alebo negatívna. Alebo vyjadrené číselne v g / l. (pozri obrázok č.8).